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[求助]
關于野生菌為宿主表達的三親結合法
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| 我現(xiàn)在在污水中分離出一株枯草芽孢桿菌，我現(xiàn)在想把我分離的外源基因轉入此菌中，我看現(xiàn)在網上資源有些做野生菌的表達用的是三親結合法，就是，供體菌、輔助菌、受體菌三種菌混合培養(yǎng)的一種廣法，但是這方面的資源特別的少，我想知道這種方法中用的載體哪種比較好，是用的大腸表達載體、枯草表達載體還是穿梭表達載體。就是除了三親結合法，之外還有沒有好的構建工程菌的方法了。謝謝了，我才來不久金幣有些少，請大家多包涵了。 |
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3樓2011-08-24 09:56:16
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【答案】應助回帖
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dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-25 07:48:09
鉛釙鍶釔(金幣+10): 2011-08-29 10:28:10
dhd997(金幣+5, MolEPI+1): good 2011-08-25 07:48:09
鉛釙鍶釔(金幣+10): 2011-08-29 10:28:10
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芽孢桿菌屬的一般比較難轉化得了~我們實驗室通常用一下方法~希望能對你有用 ①取受體菌接種于BY培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)到對數(shù)生長早中期。此時OD620應在0.4左右，培養(yǎng)時間約為4～5小時。 ②將培養(yǎng)后的菌液離心，棄去上清液，再用生長培養(yǎng)基（GM液）洗菌一次，然后將菌體細胞重新懸浮在與BY培養(yǎng)液等體積的GM液中。37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長后期。此時OD620應在0.6～0.9，培養(yǎng)時間約為3～5小時。 ③以1:10的比例將GM液中培養(yǎng)的菌液稀釋于轉化培養(yǎng)基（TM液）中。即取菌液0.2ml加入1.8mlTM液中，在20×150mm的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)90分鐘。 ④加入供體質粒，至最終濃度1ug/ml，于20×150mm的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)30分鐘。 ⑤取200ul涂布抗性選擇平板，37℃培養(yǎng)48小時。 【培養(yǎng)基配方】 A. BY培養(yǎng)基：牛肉膏5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。 B. 1×最低鹽溶液：K2HPO4 14g（K2HPO4•3H2O 18.34g），K2HPO4 6g，(NH4)2SO4 2g，檸檬酸鈉（Na3C6H5O7•2H2O）1g，MgSO4•7H2O 0.2g，在蒸餾水中依次溶解，加水至1000ml。 C. L- trp溶液，2mg/ml，貯于棕色瓶內，用黑紙包裹。（過濾滅菌） D. 生長培養(yǎng)基：GM，使用時混合比例。1×最低鹽溶液100ml，1M硫酸鎂0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.4ml，10%酵母汁1ml，L-trp 50ug/ml。 E. 轉化培養(yǎng)基：TM，使用時混合比例。1×最低鹽溶液100ml，1M硫酸鎂0.5ml，50%葡萄糖1ml，5%水解酪蛋白0.2ml，L-trp 5ug/ml。 其中 50% 葡萄糖 過濾滅菌 5%水解酪蛋白和10%酵母汁均可高溫滅菌 至于載體你可以試試 pAX01這是一個適用于芽孢桿菌屬的過表達載體  |
4樓2011-08-24 22:55:50
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