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guoting329銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
連接轉(zhuǎn)化
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載體用的3300.片段大小1800bp,16°過夜連接，在卡那抗性的板上長出來了，但搖 菌怎么都搖不起來，搖菌用的是卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基，難道板上長的全部都是假陽性嘛？是什么原因造成的呢？？哪位大俠能幫忙解釋下，謝謝！��！ [ 來自科研家族 海外留學(xué) ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-30 15:27:44
guoting329(金幣+5): 很好 2011-08-30 16:52:17
西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-30 15:27:44
guoting329(金幣+5): 很好 2011-08-30 16:52:17
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1：你的載體上有無篩選標記，比如說LacZ等，如果有的話可以借助篩選標記完成你的克隆； 2：固體板子上長出來，在液體里要不出來原因可能： 2.1：液體LB一般比固體敏感一些，所以用Kan濃度應(yīng)該比固體稍微低一些，當(dāng)然了，你如果用相同濃度也可以，但是如果不長，并不一定是假陽性，有可能是液體中濃度過大導(dǎo)致長不起來，這時候就需要降低液體中的抗生素濃度； 2.2 ：假陽性 2.3：其實你可以挑取長出來的單克隆劃線在相同濃度的抗生素板子上，然后PCR，提取質(zhì)粒驗證。。。當(dāng)然了你選擇菌液PCR也可以的； 3：你連接過程中有問題，當(dāng)然了從以下幾方面改進： 3.1：載體和基因雙酶切是否完全？純化呢？ 3.2：載體和基因純化完之后，電泳定量，然后確定連接體系中載體和基因的添加量。。。有可能是你連接體系不太合適。 4：針對目前的情況，就是把板子上的單克隆劃線在相同濃度的板子上，然后PCR驗證。。。然后提取質(zhì)粒酶切驗證。。。 祝好運。。。。  |
3樓2011-08-30 15:19:12
anlewo7777
木蟲 (正式寫手)
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2樓2011-08-30 13:06:13
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