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如何將miRNA構(gòu)建到慢病毒載體
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| 如何將miRNA構(gòu)建到慢病毒載體？以前只做過(guò)將基因構(gòu)建到質(zhì)粒載體，兩者有什么區(qū)別？最好有具體的實(shí)驗(yàn)步驟，或相關(guān)資料，不勝感激！ |
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cdl007
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金幣+5): 多謝 2011-09-08 16:21:30
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): Good 2011-09-04 18:56:06
tutufei(金幣+5): 多謝 2011-09-08 16:21:30
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一個(gè)說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，相當(dāng)簡(jiǎn)單好理解 慢病毒包裝簡(jiǎn)要程序(以六孔板中的1孔為例)： 第一天： 1.用無(wú)抗生素DMEM+10%FBS鋪板293FT細(xì)胞，2ml/孔。確保第二天細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合度 第二天： 1.轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。 1. 500ul Opti-MEM稀釋2ug pWPXLd-目的基因+1.5ug psPAX2+1.5ug pMD2.G 2. 500ul Opti-MEM稀釋15ul lipofectamine2000 3. 5min后，將，溶液混合，室溫靜止30min 4. 從6孔板中吸出1ml培養(yǎng)基，然后滴加入1ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。 2. 6-10h后，移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+ 10%FBS（從此刻開(kāi)始算時(shí)間）。 第三天： 3.轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到70%以上 第四天： 4. 48h收獲含病毒的上清，0.45um濾膜過(guò)濾， 同時(shí)再往6孔板中加入2ml完全培養(yǎng)基 4. 感染細(xì)胞：用一份病毒液+2份完全培養(yǎng)基感染目的細(xì)胞。 第五天： 5. 72h后再次收獲病毒上清。將昨天感染的細(xì)胞離心去除上清，然后再次感染目的細(xì)胞。 6. 一般感染48h后，就能見(jiàn)到明顯的熒光。 |
2樓2011-09-04 18:41:16
cdl007
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
dhd997(金幣+2): 專家就是專家 2011-09-09 07:46:49
dhd997(金幣+2): 專家就是專家 2011-09-09 07:46:49
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http://www.stemcell8.cn/forum-viewthread-tid-41159-highlight.html 這個(gè)網(wǎng)址上的更詳細(xì)，，俺倒是想做，可惜實(shí)驗(yàn)室條件不夠。。。。。 |
3樓2011-09-04 18:59:41
l-c-l
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-09-07 17:17:21
wanhscn(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-09-07 17:17:21
| 慢病毒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)條件要求并不高，只要能弄到所需的載體就比較簡(jiǎn)單了。載體構(gòu)建部分就是常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，最主要是看包裝效率，要求較高的就是氯化鈣了，基本用進(jìn)口的高純才可以（當(dāng)然不選用該系統(tǒng)不作考慮）。若是包裝效率好的話，得到的毒液滴度也是足夠感染Jurkat等難以轉(zhuǎn)染的白血病等細(xì)胞株，此時(shí)可以不經(jīng)過(guò)濃縮，因?yàn)闈饪s需要超高速離心（8萬(wàn)），這個(gè)還是比較難辦的。 |
4樓2011-09-07 15:46:55
5樓2011-09-08 14:44:54
l-c-l
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6樓2011-09-09 07:35:28
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7樓2012-02-21 15:28:23
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8樓2012-09-07 10:05:18
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9樓2012-11-06 14:04:10
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