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xiaoqiang100鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
ELISA測(cè)抗體效價(jià)的準(zhǔn)確性問(wèn)題
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| 我用ELISA夾心法測(cè)抗體效價(jià)，底物是蛋白，一抗是我們要測(cè)的抗體，二抗是山羊抗兔的HRP標(biāo)記的，顯色物為OPD。但是我感覺(jué)，OPD反應(yīng)的時(shí)間越長(zhǎng)，OPD顯色就越深，O.D值就越高，這樣我們用軟件分析得出的抗體的效價(jià)就不一樣。打個(gè)比方說(shuō)：前面所有的條件完全相同，在顯色這一步，我有的顯色5分鐘，有的顯色10分鐘。因?yàn)轱@色10分鐘的O.D值比五分鐘大，那么我算出來(lái)的同一種抗體的效價(jià)就會(huì)不同。這個(gè)問(wèn)題該如何解決呢？另外，我們的抗體還沒(méi)有商業(yè)化抗體，所以無(wú)法利用現(xiàn)有的商業(yè)抗體進(jìn)行校準(zhǔn)。 |
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zlee2136
木蟲(chóng) (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
xiaoqiang100(金幣+2): 我將具體條件寫(xiě)了一下，還請(qǐng)得到你的幫助 2011-09-09 09:12:38
| 你這種方法應(yīng)該叫間接ELISA法，請(qǐng)問(wèn)你檢測(cè)的抗體有沒(méi)有做一個(gè)稀釋梯度？說(shuō)一個(gè)抗體的效價(jià)有多少，應(yīng)該同時(shí)要說(shuō)明你的檢測(cè)條件，比如：抗原包板濃度，包板時(shí)間，一抗稀釋度，二抗使用濃度，底物顯色時(shí)間，各步反應(yīng)時(shí)間等等！不能一概而論，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)都不太一樣！ |
2樓2011-09-08 22:55:58
xiaoqiang100
鐵蟲(chóng) (小有名氣)
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- 專(zhuān)業(yè): 生化分析及生物傳感
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好的，我將具體條件說(shuō)一下。 我抗原包被的濃度為8微克/孔，37℃孵育2小時(shí)； 百分之五的牛血清蛋白封閉，37℃孵育2小時(shí)； 梯度稀釋抗體血清，稀釋梯度為1:100至1:1000000000，37℃孵育2小時(shí)； PBST洗5次，每次5min； 加入山羊抗兔二抗（我們做的一抗是兔源的），稀釋2000，37℃孵育2小時(shí)； PBST洗5次，每次5min； OPD顯色（配方為0.05%w/v的OPD,0.1%v/v的過(guò)氧化氫，溶解在ph5.3的檸檬酸緩沖液中）； 1M的硫酸中止反應(yīng)； 5min內(nèi)測(cè)量O.D值。 |
3樓2011-09-09 09:11:58
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