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flyhbsa002新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
如何做同源重組
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本人初涉基因敲除，請(qǐng)教各位大俠！ 我要做絲狀真菌基因敲除，可是這個(gè)基因序列未知（1200bp），我只擴(kuò)到了五百多個(gè)bp的保守序列，也用TALE-PCR擴(kuò)增了其側(cè)翼序列了，但只擴(kuò)到了850bp.想問(wèn)問(wèn)大家 ，可以用這850bp片段直接做敲除嗎？同源臂有什么要求啊？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助。 2011-09-10 23:12:04
wanhscn(金幣+3): good，鼓勵(lì)繼續(xù)交流 2011-09-11 08:16:08
amisking(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助。 2011-09-10 23:12:04
wanhscn(金幣+3): good，鼓勵(lì)繼續(xù)交流 2011-09-11 08:16:08
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基因片段太短，直接敲除有點(diǎn)困難。 同源重組頻率與交換片段的長(zhǎng)度有關(guān)，一般說(shuō)來(lái)，同源臂的長(zhǎng)度應(yīng)不短于 500 bp，且兩同源臂的長(zhǎng)度應(yīng)大致相等，否則會(huì)對(duì)雙交換菌株的篩選造成困難。 |
2樓2011-09-10 21:01:08
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3樓2011-09-10 21:12:23
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4樓2011-09-11 11:07:55
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5樓2011-09-14 09:07:12
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【答案】應(yīng)助回帖
flyhbsa002(金幣+5): 嘿嘿！ 2011-09-14 09:25:00
| 之前阻斷時(shí)可以不用擴(kuò)增完整基因，但是你后續(xù)試驗(yàn)中要做遺傳互補(bǔ)，以排除極性效應(yīng)或自發(fā)突變的情況，以確保是基因被阻斷后產(chǎn)生的影響，因此要做遺傳互補(bǔ)，這時(shí)就需要把整個(gè)完整的基因給導(dǎo)回到基因阻斷突變株中表達(dá)，以排除別的原因，所以，后面需要一個(gè)表達(dá)載體，所以完整的基因也是要擴(kuò)的。 |
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flyhbsa0026樓2011-09-14 09:14:52
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7樓2011-09-14 09:24:28
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