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DNA的提取簡(jiǎn)介，包括法醫(yī)DNA的提取方法！
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一.DNA的提取方法簡(jiǎn)介 為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA.由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。 動(dòng)植物中，小牛胸腺۰動(dòng)物肝臟۰魚(yú)類精子，植物種子的胚中都含有豐富的DNA。 微生物中，谷氨酸菌體含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大腸肝菌含9%~10%。 從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。 對(duì)于低等生物。如從病毒中提取DNA 比較容易，多數(shù)病毒DNA 分子量較小，提取時(shí)易保持其結(jié)構(gòu)完整性。 從細(xì)菌及高等動(dòng)植物中提取DNA難度大一些。細(xì)菌DNA 分子量較大，一般達(dá)2×10 道爾頓。因此易被機(jī)械張力剪斷。細(xì)菌DNA，除核DNA 外，還有質(zhì)粒DNA 等。 1、核酸的理化性質(zhì) RNA和核苷酸的純品都呈白色粉末或結(jié)晶，DNA則為白色類似石棉樣的纖維狀物。除肌苷酸、鳥(niǎo)苷酸具有鮮味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水，RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)40g/L。DNA在水中為10g/L，呈黏性膠體溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取DNA 時(shí)，先把DNP抽提出來(lái)，再把P除去，再除去細(xì)胞中的糖，RNA 及無(wú)機(jī)離子等，從中分離DNA 。 DNP和RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響而不同。DNP在低濃度鹽溶液中，幾乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化鈉溶解度最低，僅為在水中溶解度的1%，隨著鹽濃度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化鈉中的溶解度很大，比純水高2倍。 RNP在鹽溶液中的溶解度受鹽濃度的影響較小，在0.14mol/L氯化鈉中溶解度較大。因此，在提取時(shí)，常用此法分離這兩種核蛋白。 2.細(xì)胞的破碎 細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方 法有三種：①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。 由于高等動(dòng)物DNA 主要存在于細(xì)胞核與線粒體中，所以提取時(shí)有兩個(gè)困難（高等植物與此類似）： ①破碎細(xì)胞難；從處死動(dòng)物٠分離組織器宮到破碎細(xì)胞費(fèi)時(shí)長(zhǎng)。在此時(shí)期間DNA 可能會(huì)被DN ase降解，而動(dòng)物組織：特別是肌肉組織很難破碎,即使是較易破碎的肝٠腎等組織也往往使用組織勻漿器，易造成DNA 斷裂。 ②分子量大，一般比細(xì)菌的大2—3個(gè)數(shù)量級(jí)，比病毒的大4—5個(gè)數(shù)量。對(duì)不同生物材料，要根據(jù)具體情況選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x提取方法。 3.DNA提取的幾種方法 (1).濃鹽法 利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來(lái). 也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白. 兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些. 以稀鹽酸溶液提取DNA 時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過(guò)程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA. （2）.陰離子去污劑法: 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA. （3）.苯酚抽提法: 苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài) . （ 4）.水抽提法: 利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66% ٠80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過(guò)程中加入SDS.[ Last edited by wanhscn on 2011-9-20 at 14:56 ] |
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