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小丫的維尼熊木蟲 (小有名氣)
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[交流]
DNA的連接反應(yīng) 已有4人參與
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1. 外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略 1.1 帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。 1.2 帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。 1.3 帶有平末端 由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。 1.4 特殊情況 外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。 2. 注意事項(xiàng) 2.1 DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。 2.2 接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。 2.3 連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲(chǔ)存數(shù)天，-80℃儲(chǔ)存2個(gè)月，但是在-20℃冰凍保存將會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 2.4 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。 2.5 在連接反應(yīng)中，如不對(duì)載體分子進(jìn)行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機(jī)會(huì)。 2.6 麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍(lán)白斑篩選，且價(jià)格低廉。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色，影響挑選。 2.7 在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。 生物一一四，生物導(dǎo)航之家。 |
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2樓2011-10-03 23:02:31
3樓2011-10-03 23:07:11
molecula
鐵桿木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 病原細(xì)菌與放線菌生物學(xué)
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小木蟲(金幣+0.5):給個(gè)紅包，謝謝回帖
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不是說平末端 粘末端哪個(gè)好連的問題 而是說現(xiàn)在基本上都不會(huì)用平末端去做鏈接 除非特殊要求 平末端的特性在于會(huì)出現(xiàn)非特異性鏈接 也就是說 兩個(gè)平末端連在一起未必是我們需要的片段或者環(huán) 所以 現(xiàn)在平末端上都會(huì)搭載一個(gè)信號(hào)標(biāo)簽或者是蛋白標(biāo)簽 增加其鏈接的特異性 粘末端的特異性在于伸出來的那部分DNA單連 的確會(huì)出現(xiàn)非特異性連接 但是 對(duì)于粘末端而言 這部分非特異性連接少之又少 之后的PCR和雙酶切都是為了排除這種可能性出現(xiàn) |
4樓2011-10-04 00:15:47
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5樓2011-12-03 16:09:41
悠悠米
新蟲 (初入文壇)
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- 專業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
6樓2014-09-26 12:40:31
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