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小丫的維尼熊木蟲 (小有名氣)
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[交流]
DNA的連接反應(yīng) 已有4人參與
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1. 外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略 1.1 帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。 1.2 帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復(fù)。 1.3 帶有平末端 由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。 1.4 特殊情況 外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進行連接。 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點,可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補并進行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。 2. 注意事項 2.1 DNA連接酶用量與DNA片段的性質(zhì)有關(guān)，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。 2.2 接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。 2.3 連接反應(yīng)后，反應(yīng)液在0℃儲存數(shù)天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉(zhuǎn)化效率。 2.4 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應(yīng)溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。 2.5 在連接反應(yīng)中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段（2-5倍），這將有助于減少載體的自身環(huán)化，增加外源DNA和載體連接的機會。 2.6 麥康凱選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。該產(chǎn)品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。 2.7 在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時可使顯色反應(yīng)充分，藍色菌落明顯。 生物一一四，生物導(dǎo)航之家。 |
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