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小木蟲論壇-學(xué)術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 綜合其他 » 報告基因
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小丫的維尼熊木蟲 (小有名氣)
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報告基因 已有6人參與
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定義 報告基因 (reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。 特征 作為報告基因，在遺傳選擇和篩選檢測方面必須具有以下幾個條件： (1)已被克隆和全序列已測定； (2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無背景，在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物； (3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測定。 應(yīng)用 在植物基因工程研究領(lǐng)域，已使用的報告基因有以下幾種：胭脂堿合成酶基因(nos)、章魚堿合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。nos、ocs這兩個基因是致瘤土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti質(zhì)粒特有的，對Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，用相應(yīng)的致瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物體時，如果外源基因轉(zhuǎn)入植物體中，則這兩種報告基因在植物根莖葉中均能表達(dá)，不受發(fā)育調(diào)控，檢測時直接用轉(zhuǎn)化體提取液進(jìn)行紙電泳，染色后在紫外光下觀察熒光即可。nptⅡ、cat及慶大霉素轉(zhuǎn)移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關(guān)的酶可以對底物進(jìn)行修飾(磷酸化、乙�；�)，從而使這些抗生素失去對植物生長的抑制作用，使得含有這些抗性基因的轉(zhuǎn)化體能在含這些抗生素的篩選培養(yǎng)基上正常生長，也可以用轉(zhuǎn)化體提取液體，外用同位素標(biāo)記，放射自顯影篩選轉(zhuǎn)化體。目前常用的一種報告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學(xué)檢測很穩(wěn)定，可用分光光譜、熒光等進(jìn)行檢測。熒光酶基因(luc)是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2＋、O2和熒光素存在下發(fā)出熒光，這樣就可用轉(zhuǎn)基因植物整株或部分直接用X-光片或?qū)ｉT儀器進(jìn)行檢測。 在動物基因表達(dá)調(diào)控的研究中，報告基因也被廣泛應(yīng)用。常用的有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、二氫葉酸還原酶基因、熒光酶基因等。cat基因作為報告基因，檢測時可通過放射自顯影觀察。熒光酶基因作為報告基因，具有檢測速度快、靈敏度比cat基因高30～1000倍、費用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點，得到了廣泛的采用。 此外，在反式作用因子相互作用的檢測方式棗酵母雙雜交體系中，可通過報告基因的表達(dá)，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。雙雜交體系是由報告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、報告基因及一對可以相互作用的雜合反式作用因子組成。近年來從上述雜交體系中發(fā)展出的單一雜交體系技術(shù)，也是根據(jù)報告基因表達(dá)量的檢測篩選出與已知順式作用元件相結(jié)合的未知因子的DNA，該項技術(shù)正廣泛應(yīng)用于克隆細(xì)胞中含量微弱且用生化手段難以純化的反式作用因子。 58gus報告基因 gus基因就是轉(zhuǎn)β-葡糖醛酸酶基因 該基因產(chǎn)物為GUS 蛋白質(zhì)，相當(dāng)穩(wěn)定而不易降解，并為一水解酵素，有簡易的測定方法；且可使用市售的基質(zhì) (substrate) 在原位 (in situ) 顯現(xiàn)出酵素的活性，以肉眼即可檢測其產(chǎn)物，非常方便。 gus基因存在于E.coli等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一個水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個基因被廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。根據(jù)地gus基因檢測所用的底物不同，可以選擇三種檢測方法：組織化學(xué)法、分光光度法和熒光法（靈感度為分光光度檢測法最高），其中最為常用的是組織化學(xué)法。 組織化學(xué)法檢測以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）作為反應(yīng)底物。將被檢材料用含有底物的緩沖液浸泡，若組織細(xì)胞發(fā)生了解gus基因的轉(zhuǎn)化，并表達(dá)出Gus，在適宜的條件下，該酶就可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，這是由其初始產(chǎn)物經(jīng)氧化二聚作用于形成的靛藍(lán)染料，它使具Gus活性的部位或位點呈現(xiàn)藍(lán)色，用肉眼或在顯微鏡下可看到，且在一定程度下根據(jù)染色深淺可反映出Gus活性。因此利用該方法 可觀察到外源基因在特定器官、組織，甚至單個細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 GUS作為報告基因的優(yōu)缺點 采用報告基因是gus基因，它具有以下一些優(yōu)點： ①利用一個簡單的組織化學(xué)檢測就可以精確地分析gus融合基因的時空表達(dá)模式。 ②GUS蛋白在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中穩(wěn)定存在，它對較高的溫度及去污劑有一定的耐受性。 ③檢測方法簡單，可以進(jìn)行定性和定量檢測。以X-Gluc為底物，通過顯色反應(yīng)可直接觀察組織器官中g(shù)us基因的活性；以4-MUG為底物，GUS蛋白可以催化其水解為4-MU和β-D葡萄糖醛酸，4-MU分子中的羥基解離后被365nm的光激發(fā)，產(chǎn)生455nm熒光，可用熒光分光光度計定量檢測。 ④在大多數(shù)植物組織中GUS活性的本底低； ⑤檢測時只需少量植物組織。 但是，在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)其存在一些不足： ① 染色不均勻。通常在傷口處較深。對材料進(jìn)行抽真空處理可以提高GUS染液的滲透能力，但是不能從根本上解決這一問題；實驗中發(fā)現(xiàn)對需進(jìn)行染色的材料進(jìn)行徒手切片，再進(jìn)行染色會使染色效果得到改善。 ② 不能進(jìn)行活體染色。組織化學(xué)染色后愈傷失去繼續(xù)培養(yǎng)的可能，在檢測莖桿和葉鞘時會對材料造成很大的傷害及損失。 ③ 不能進(jìn)行亞細(xì)胞定位。如需要進(jìn)行亞細(xì)胞定位，可用gfp作為報告基因。 生物一一四，生物導(dǎo)航之家。 |
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