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chuey木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求助微生物琥珀酸脫氫酶測定問題
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| 到底怎么處理啊，是要上清液還是沉淀啊。線粒體怎么破碎啊 ？ |
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chuey
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3樓2011-10-11 20:29:01
HarveyWang
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金幣+5, MicEPI+1): 強大，學習了 2011-10-11 20:56:17
scelab(金幣+5, MicEPI+1): 強大，學習了 2011-10-11 20:56:17
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線粒體測定SDH可以用磷酸緩沖液破碎，pH就用SDH測定反應(yīng)液的pH即可，一般為pH7.5。就用100 mM的KH2PO4-NaOH冰浴懸浮，超聲破碎。一般50-100次超聲，每次3sec，間隔5sec。 若破碎液只是測定SDH，則可以再破碎后向其中加入2%的Tween-80，然后震蕩幾分鐘，這樣可以充分提取SDH。 SDH 測定需要細胞全液。SDH在細胞破碎液離心上清和細胞沉淀中 都有，都不能忽略。不信，你可以分別測定上清和沉淀的SDH活性看看。 |
2樓2011-10-11 20:07:31
HarveyWang
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scelab(金幣+9, MicEPI+1): 謝謝熱心回復~ 2011-10-13 01:00:12
scelab(金幣+9, MicEPI+1): 謝謝熱心回復~ 2011-10-13 01:00:12
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你破碎真菌的菌絲體，就相當于破碎線粒體了。 如果你只想測定線粒體的SDH活性，那么你需要先提取線粒體再測定。 用全液，當然有懸浮物， 關(guān)鍵是你要的是全液的，還是上清的，還是沉淀的SDH活性。 一般來說，測定時20-50uL 測活性就夠了。 在反應(yīng)的保溫階段，樣品造成的吸光值背景就穩(wěn)定了。 而你測定的是吸光值的下降。 我是加入底物啟動反應(yīng)，而不是加入酶液啟動反應(yīng)的。 |
4樓2011-10-11 21:28:13
chuey
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5樓2011-10-12 20:17:34
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