 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 2097 | 回復(fù): 4 | |||
xiajing_acm新蟲 (小有名氣)
|
[求助]
關(guān)于Western的許多不明白與不清楚的地方
|
|
給位大俠： 你們好！ 我剛開始做western，試驗中碰到許多問題，勞駕幫我一下，非常感謝！ 我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及內(nèi)參beta-actin（42KD）。 1、關(guān)于加樣及電泳：因為我做的大部分是核蛋白，所以提核蛋白做的。可核蛋白濃度每次提的都很低，最小的只有0.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上樣量44ul)最多大約只能加20ug，不知道上樣量是不是不夠呢？上樣的時候總有樣品溢出污染另一孔，對于上大體積的樣大家有好的加樣方法嗎？p21較小，電泳的時候跑到底20KD Marker都看不清楚，該如何判斷是否已經(jīng)跑開了呢？ 2、關(guān)于轉(zhuǎn)膜：我用的濕轉(zhuǎn)0.45umPVDF膜，第一次用250mA轉(zhuǎn)2h，發(fā)現(xiàn)預(yù)染Marker已經(jīng)轉(zhuǎn)到濾紙上了，可曝光內(nèi)參條帶還比較清晰，p21沒有條帶；第二次用250mA轉(zhuǎn)1h，p21隱約有條帶，而250mA轉(zhuǎn)2h發(fā)現(xiàn)CyclinD1與HDAC3卻沒有條帶。請教下大家：預(yù)染Marker轉(zhuǎn)到濾紙上就證明蛋白轉(zhuǎn)過了嗎？我到底該如何選擇p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及內(nèi)參beta-actin（42KD）的轉(zhuǎn)膜條件呢？ 3、一抗孵育：這里要說一下，我的抗體p21與CyclinD1是Santa的，p21已經(jīng)過了1年零8個月的樣子，CyclinD1快到一年；HDAC3與HDAC4是CST的，超過送貨期1年8個月了，不知道做的效果不好是不是跟抗體過期有關(guān)��？可是內(nèi)參時間也過了很久能做出來啊，這是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎樣檢驗一抗是否過期及效價呢？還有，沒有熱熔機該如何孵育一抗呢？室溫還是4度過夜？ 4、發(fā)光及顯影：發(fā)光液加到膜上一般發(fā)光多久曝光呢？尤其是看不到熒光的情況下？是不是等一段時間��？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有時候加發(fā)光液后整個膜發(fā)亮，但不見熒光條帶是怎么回事呢？還有，曝光的時間一般多少比較好��？ 問題太多，希望大家?guī)蛶兔Π�！謝謝啦！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 蛋白質(zhì)生物學(xué)實驗經(jīng)驗 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗中的趣事：實驗器材的 “烏龍”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗中的趣事：和實驗材料的 “斗智斗勇”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有180人回復(fù)
-
蛋白質(zhì)檢測：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準(zhǔn)篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 初入這一行的小菜鳥繼續(xù)您的幫助，關(guān)于凝膠柱和PH試紙的不清楚的地方
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 拿了個offer，不過有些地方不明白，關(guān)于德國DAAD的
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 填寫香港的FORM ID990a 有幾個地方不明白
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 求助：petro mod軟件中幾點不明白的地方，請求幫助
已經(jīng)有9人回復(fù)
- ORIGIN畫的四合一圖，放在WORD上有點看不清楚，能拉對角放大嗎？謝謝！
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助】關(guān)于guess=alter的一個不明白的地方。
已經(jīng)有5人回復(fù)
- western blot 半干轉(zhuǎn)膜后，發(fā)現(xiàn)條帶個別缺失，不知道什么原因，請教各位
已經(jīng)有1人回復(fù)
liangzi3241
金蟲 (著名寫手)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 11481.9
- 散金: 4299
- 紅花: 7
- 帖子: 1873
- 在線: 391.6小時
- 蟲號: 1229617
- 注冊: 2011-03-11
- 專業(yè): 等離子體物理
2樓2011-10-18 15:20:38
fisheart
金蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 1086.7
- 紅花: 10
- 帖子: 131
- 在線: 20小時
- 蟲號: 1332157
- 注冊: 2011-06-27
- 專業(yè): 人類遺傳學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
xiajing_acm(金幣+5): 2011-10-20 20:07:19
|
1 不知道你是用什么方法提蛋白的，蛋白量低，可以通過擴大細(xì)胞培養(yǎng)，多裂些細(xì)胞。上樣，盡量不用全部上滿，上樣速度快點，否則樣品會漂的。電泳時間當(dāng)然是看marker了，跑 p21這樣的小蛋白，膠配濃一些的，用12%的，以及 marker看不清楚是什么意思@@預(yù)染marker就是讓你看大小決定電泳什么時候停止的 2 轉(zhuǎn)膜時間是根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小來看的，不可能一個條件所有大小蛋白質(zhì)都是最好條件，大分子量蛋白要轉(zhuǎn)時間長否則不充分，小分子量蛋白要轉(zhuǎn)短，否則容易轉(zhuǎn)過，這個還要結(jié)合上樣量和蛋白質(zhì)表達的量，marker轉(zhuǎn)到濾紙，內(nèi)參還有信號，是因為內(nèi)參本身表達量就高，留在膜里的部分就相當(dāng)多，自然能檢測到信號�？梢韵仍囋�100V轉(zhuǎn)1：30min，根據(jù)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整，如果蛋白信號差距大，建議分開轉(zhuǎn)膜。 3 不同的抗體性質(zhì)不一樣，有些過期很多年都沒關(guān)系，可以先過量使用一抗體，看看有沒有信號。正常的孵育時間室溫1h, 或者4度過夜都可以，4度過夜效果好些。 4 發(fā)光液孵育時間看說明書，曝光時間是根據(jù)信號強弱調(diào)整的 |
3樓2011-10-18 15:59:58
★
wanhscn(金幣+1): 鼓勵交流 2011-10-23 11:18:19
wanhscn(金幣+1): 鼓勵交流 2011-10-23 11:18:19
|
關(guān)于轉(zhuǎn)膜：內(nèi)參條帶還比較清晰，p21沒有條帶，內(nèi)參大于P21可能，p21轉(zhuǎn)過了；p21隱約有條帶，而250mA轉(zhuǎn)2h發(fā)現(xiàn)CyclinD1與HDAC3卻沒有條帶，因該是轉(zhuǎn)的時間不到。具體條件你得摸下 一抗，4度過夜較好，先濃一點做出條帶來再優(yōu)化。特異性好不好，你得檢測下，最好使用文獻報道的或其他實驗室做了沒問題的抗體，否則不太好做出來。至于過期應(yīng)該不是太大的問題，只要不是過期很久就可以，多加些就是了。 |
4樓2011-10-18 16:55:36
飛雪流螢
銀蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 248.4
- 帖子: 20
- 在線: 8.4小時
- 蟲號: 1445894
- 注冊: 2011-10-16
- 專業(yè): 抗腫瘤藥物藥理
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
wanhscn(金幣+3): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-10-23 11:18:30
xiajing_acm(金幣+45): 5 2011-10-24 10:07:49
wanhscn(金幣+3): 鼓勵應(yīng)助！ 2011-10-23 11:18:30
xiajing_acm(金幣+45): 5 2011-10-24 10:07:49
|
1.一般電泳儀應(yīng)該配套1.5mm的梳子吧，20μg的蛋白量可以吧，我做的上30μg的上樣量曝光時間很短的，還有樓主的上樣槍頭是不是那種很長的，那種的好用些。我做過分力量為23左右的蛋白，用的是12%的膠，maker可以適當(dāng)加量吧，應(yīng)該挺清楚地。 2.我轉(zhuǎn)膜時用的是106v的恒壓，問題不大（目的蛋白最低23，最高95）不知是不是用于你的實驗。 3.我導(dǎo)師從外面回來時帶回來的一抗，估計不太到一年，就沒有什么效果了，你的一抗是不是也不太好了？當(dāng)然也可能是跟你膜上的目的蛋白豐度不太大有關(guān)，你用麗春紅染液染染看看，在相應(yīng)位置是否用條帶。封口機很便宜的也不用太好，這樣關(guān)鍵是節(jié)省抗體，以前沒有的時候我們用個小方盒，包上保鮮膜，4℃過夜，那樣抗體蒸發(fā)很厲害，你可以在保鮮膜上壓下一個小錐形，讓蒸發(fā)的液體都集中在錐形頂端，方便回收。 4.加入發(fā)光試劑后可適當(dāng)?shù)鹊�，關(guān)上燈看看，要是看不到很可能就沒有蛋白，要是全膜都發(fā)亮要不就是你的一抗特異性不強，要不就是封閉有問題，曝光時間你自己可以摸索一下，膜是可以重復(fù)曝光的，如果熒光消失了，可用TBST清洗一下，再加上發(fā)光試劑就可以再用了。 我也剛開始做，有些不一定對，希望哪點可以幫到你 |
5樓2011-10-23 11:13:57
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 xiajing_acm 的主題更新
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 281求調(diào)劑（0805） +6 | 煙汐憶海 2026-03-16 | 16/800 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 一志愿吉林大學(xué)材料學(xué)碩321求調(diào)劑 +4 | Ymlll 2026-03-18 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿天津大學(xué)化學(xué)工藝專業(yè)（081702）315分求調(diào)劑 +10 | yangfz 2026-03-17 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 【同濟軟件】軟件（085405）考研求調(diào)劑 +3 | 2026eternal 2026-03-18 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 一志愿中國海洋大學(xué)，生物學(xué)，301分，求調(diào)劑 +4 | 1孫悟空 2026-03-17 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 化學(xué)工程321分求調(diào)劑 +15 | 大米飯！ 2026-03-15 | 18/900 |
|
|
|
[考研] 材料與化工一志愿南昌大學(xué)327求調(diào)劑推薦 +8 | Ncdx123456 2026-03-13 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +3 | 冷笙123 2026-03-17 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 268求調(diào)劑 +6 | 簡單點0 2026-03-17 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工求調(diào)劑 +5 | 緒幸與子 2026-03-17 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 302求調(diào)劑 +4 | 小賈同學(xué)123 2026-03-15 | 8/400 |
|
|
|
[考研]
 11408 一志愿西電，277分求調(diào)劑
+3
|
zhouzhen654 2026-03-16 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 085600調(diào)劑 +5 | 漾漾123sun 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 本科南京大學(xué)一志愿川大藥學(xué)327 +3 | 麥田耕者 2026-03-14 | 3/150 |
|
|
|
[基金申請] 現(xiàn)在如何回避去年的某一個專家，不知道名字 +3 | zk200107 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 330求調(diào)劑 +3 | ?醬給調(diào)劑跪了 2026-03-13 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 307求調(diào)劑 +5 | 超級伊昂大王 2026-03-12 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工 309分請求調(diào)劑 +7 | dtdxzxx 2026-03-12 | 8/400 |
|
|
|
[論文投稿]
投稿問題
 5+4
|
星光燦爛xt 2026-03-12 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 290求調(diào)劑 +3 | ADT 2026-03-13 | 3/150 |
|