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xiajing_acm新蟲 (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于Western的許多不明白與不清楚的地方
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給位大俠： 你們好！ 我剛開始做western，試驗(yàn)中碰到許多問題，勞駕幫我一下，非常感謝！ 我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及內(nèi)參beta-actin（42KD）。 1、關(guān)于加樣及電泳：因?yàn)槲易龅拇蟛糠质呛说鞍�，所以提核蛋白做的�？珊说鞍诐舛让看翁岬亩己艿�，最小的只�?.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上樣量44ul)最多大約只能加20ug，不知道上樣量是不是不夠呢？上樣的時(shí)候總有樣品溢出污染另一孔，對(duì)于上大體積的樣大家有好的加樣方法嗎？p21較小，電泳的時(shí)候跑到底20KD Marker都看不清楚，該如何判斷是否已經(jīng)跑開了呢？ 2、關(guān)于轉(zhuǎn)膜：我用的濕轉(zhuǎn)0.45umPVDF膜，第一次用250mA轉(zhuǎn)2h，發(fā)現(xiàn)預(yù)染Marker已經(jīng)轉(zhuǎn)到濾紙上了，可曝光內(nèi)參條帶還比較清晰，p21沒有條帶；第二次用250mA轉(zhuǎn)1h，p21隱約有條帶，而250mA轉(zhuǎn)2h發(fā)現(xiàn)CyclinD1與HDAC3卻沒有條帶。請(qǐng)教下大家：預(yù)染Marker轉(zhuǎn)到濾紙上就證明蛋白轉(zhuǎn)過了嗎？我到底該如何選擇p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及內(nèi)參beta-actin（42KD）的轉(zhuǎn)膜條件呢？ 3、一抗孵育：這里要說一下，我的抗體p21與CyclinD1是Santa的，p21已經(jīng)過了1年零8個(gè)月的樣子，CyclinD1快到一年；HDAC3與HDAC4是CST的，超過送貨期1年8個(gè)月了，不知道做的效果不好是不是跟抗體過期有關(guān)��？可是內(nèi)參時(shí)間也過了很久能做出來啊，這是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎樣檢驗(yàn)一抗是否過期及效價(jià)呢？還有，沒有熱熔機(jī)該如何孵育一抗呢？室溫還是4度過夜？ 4、發(fā)光及顯影：發(fā)光液加到膜上一般發(fā)光多久曝光呢？尤其是看不到熒光的情況下？是不是等一段時(shí)間啊？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有時(shí)候加發(fā)光液后整個(gè)膜發(fā)亮，但不見熒光條帶是怎么回事呢？還有，曝光的時(shí)間一般多少比較好啊？ 問題太多，希望大家?guī)蛶兔Π�！謝謝啦！ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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liangzi3241
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2樓2011-10-18 15:20:38
fisheart
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【答案】應(yīng)助回帖
xiajing_acm(金幣+5): 2011-10-20 20:07:19
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1 不知道你是用什么方法提蛋白的，蛋白量低，可以通過擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)，多裂些細(xì)胞。上樣，盡量不用全部上滿，上樣速度快點(diǎn)，否則樣品會(huì)漂的。電泳時(shí)間當(dāng)然是看marker了，跑 p21這樣的小蛋白，膠配濃一些的，用12%的，以及 marker看不清楚是什么意思@@預(yù)染marker就是讓你看大小決定電泳什么時(shí)候停止的 2 轉(zhuǎn)膜時(shí)間是根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小來看的，不可能一個(gè)條件所有大小蛋白質(zhì)都是最好條件，大分子量蛋白要轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)否則不充分，小分子量蛋白要轉(zhuǎn)短，否則容易轉(zhuǎn)過，這個(gè)還要結(jié)合上樣量和蛋白質(zhì)表達(dá)的量，marker轉(zhuǎn)到濾紙，內(nèi)參還有信號(hào)，是因?yàn)閮?nèi)參本身表達(dá)量就高，留在膜里的部分就相當(dāng)多，自然能檢測(cè)到信號(hào)�？梢韵仍囋�100V轉(zhuǎn)1：30min，根據(jù)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整，如果蛋白信號(hào)差距大，建議分開轉(zhuǎn)膜。 3 不同的抗體性質(zhì)不一樣，有些過期很多年都沒關(guān)系，可以先過量使用一抗體，看看有沒有信號(hào)。正常的孵育時(shí)間室溫1h, 或者4度過夜都可以，4度過夜效果好些。 4 發(fā)光液孵育時(shí)間看說明書，曝光時(shí)間是根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱調(diào)整的 |
3樓2011-10-18 15:59:58
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wanhscn(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-10-23 11:18:19
wanhscn(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-10-23 11:18:19
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關(guān)于轉(zhuǎn)膜：內(nèi)參條帶還比較清晰，p21沒有條帶，內(nèi)參大于P21可能，p21轉(zhuǎn)過了；p21隱約有條帶，而250mA轉(zhuǎn)2h發(fā)現(xiàn)CyclinD1與HDAC3卻沒有條帶，因該是轉(zhuǎn)的時(shí)間不到。具體條件你得摸下 一抗，4度過夜較好，先濃一點(diǎn)做出條帶來再優(yōu)化。特異性好不好，你得檢測(cè)下，最好使用文獻(xiàn)報(bào)道的或其他實(shí)驗(yàn)室做了沒問題的抗體，否則不太好做出來。至于過期應(yīng)該不是太大的問題，只要不是過期很久就可以，多加些就是了。 |
4樓2011-10-18 16:55:36
飛雪流螢
銀蟲 (初入文壇)
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2011-10-23 11:18:30
xiajing_acm(金幣+45): 5 2011-10-24 10:07:49
wanhscn(金幣+3): 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2011-10-23 11:18:30
xiajing_acm(金幣+45): 5 2011-10-24 10:07:49
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1.一般電泳儀應(yīng)該配套1.5mm的梳子吧，20μg的蛋白量可以吧，我做的上30μg的上樣量曝光時(shí)間很短的，還有樓主的上樣槍頭是不是那種很長(zhǎng)的，那種的好用些。我做過分力量為23左右的蛋白，用的是12%的膠，maker可以適當(dāng)加量吧，應(yīng)該挺清楚地。 2.我轉(zhuǎn)膜時(shí)用的是106v的恒壓，問題不大（目的蛋白最低23，最高95）不知是不是用于你的實(shí)驗(yàn)。 3.我導(dǎo)師從外面回來時(shí)帶回來的一抗，估計(jì)不太到一年，就沒有什么效果了，你的一抗是不是也不太好了？當(dāng)然也可能是跟你膜上的目的蛋白豐度不太大有關(guān)，你用麗春紅染液染染看看，在相應(yīng)位置是否用條帶。封口機(jī)很便宜的也不用太好，這樣關(guān)鍵是節(jié)省抗體，以前沒有的時(shí)候我們用個(gè)小方盒，包上保鮮膜，4℃過夜，那樣抗體蒸發(fā)很厲害，你可以在保鮮膜上壓下一個(gè)小錐形，讓蒸發(fā)的液體都集中在錐形頂端，方便回收。 4.加入發(fā)光試劑后可適當(dāng)?shù)鹊龋P(guān)上燈看看，要是看不到很可能就沒有蛋白，要是全膜都發(fā)亮要不就是你的一抗特異性不強(qiáng)，要不就是封閉有問題，曝光時(shí)間你自己可以摸索一下，膜是可以重復(fù)曝光的，如果熒光消失了，可用TBST清洗一下，再加上發(fā)光試劑就可以再用了。 我也剛開始做，有些不一定對(duì)，希望哪點(diǎn)可以幫到你 |
5樓2011-10-23 11:13:57
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