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落楓林無蟲 (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于蛋白復(fù)性問題，急急急
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我采用透析復(fù)性，尿素濃度從8-6-4-2-0M。請問氧化還原劑（我用的是GSH/GSSG體系）應(yīng)該在那個透析階段加入？是加入到透析液里吧？（不是樣品中） [ Last edited by 落楓林 on 2011-10-20 at 13:36 ] |
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tyhjqxbz
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【答案】應(yīng)助回帖
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蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問題，是在復(fù)性過程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，復(fù)性就困難；阻礙小或無阻礙的容易復(fù)性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復(fù)性率。減少中間體的形成，可選用添加小分子物質(zhì)，又叫分子伴侶，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物質(zhì)幫助蛋白質(zhì)正確折疊。避免多聚體的形成可以加入氧化還原劑（DTT、ß－ME、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），幫助蛋白質(zhì)復(fù)性中二硫鍵的正確配對，減少錯配率。 復(fù)性緩沖液的pH要遠離等電點，離子強度不易過高，10－50mmol/L，離子強度太高蛋白質(zhì)易發(fā)生沉淀，也不利于離子交換層析的分離；復(fù)性液溫度不易過高在4℃－10℃較合適對于耐熱蛋白也可以室溫復(fù)性。復(fù)性時間，以天然表達的重組蛋白復(fù)性應(yīng)在6hr以上，需要進行酶切的融和表達重組蛋白，至少要復(fù)性1hr以上，方可進行進一步的酶切。 復(fù)性方式：常用的有透析復(fù)性和稀釋復(fù)性。透析復(fù)性適用于小樣品制備；對于大樣品制備，采用稀釋復(fù)性法簡便、實用。一般包含體蛋白的復(fù)性濃度不易過大，不同的蛋白質(zhì)有所區(qū)別，一般掌握在100－200ug/ml較合適，蛋白濃度太稀使純化流程過長，蛋白濃度太濃，蛋白質(zhì)復(fù)性不完全，會直接影響蛋白的回收率。直接稀釋有困難的，也可以試用分段稀釋法。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個蛋白質(zhì)都有一個最佳的復(fù)性條件，這個最佳條件的選擇是靠大量的實驗來完成的。只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進一步的層析分離得以順利完成。 |
2樓2011-10-20 13:57:02
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3樓2011-10-20 14:07:50
nfu03200
新蟲 (初入文壇)
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4樓2012-10-10 16:59:51
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