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落楓林無(wú)蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
關(guān)于蛋白復(fù)性問(wèn)題，急急急
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我采用透析復(fù)性，尿素濃度從8-6-4-2-0M。請(qǐng)問(wèn)氧化還原劑（我用的是GSH/GSSG體系）應(yīng)該在那個(gè)透析階段加入？是加入到透析液里吧？（不是樣品中） [ Last edited by 落楓林 on 2011-10-20 at 13:36 ] |
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nfu03200
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
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- 帖子: 24
- 在線(xiàn): 29.6小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 913648
- 注冊(cè): 2009-11-26
- 專(zhuān)業(yè): 蛋白質(zhì)組學(xué)
4樓2012-10-10 16:59:51
tyhjqxbz
主管區(qū)長(zhǎng) (文壇精英)
- BioEPI: 1
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- 管轄: 注冊(cè)執(zhí)考區(qū)
【答案】應(yīng)助回帖
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蛋白質(zhì)的復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性的最大問(wèn)題，是在復(fù)性過(guò)程中形成中間體和多聚體，中間體阻礙作用大的使蛋白質(zhì)正確折疊困難，復(fù)性就困難；阻礙小或無(wú)阻礙的容易復(fù)性。降低蛋白濃度可以減少中間體形成提高復(fù)性率。減少中間體的形成，可選用添加小分子物質(zhì)，又叫分子伴侶，如精氨酸、甘油、PEG等小分子物質(zhì)幫助蛋白質(zhì)正確折疊。避免多聚體的形成可以加入氧化還原劑（DTT、ß－ME、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、Cu2＋等），幫助蛋白質(zhì)復(fù)性中二硫鍵的正確配對(duì)，減少錯(cuò)配率。 復(fù)性緩沖液的pH要遠(yuǎn)離等電點(diǎn)，離子強(qiáng)度不易過(guò)高，10－50mmol/L，離子強(qiáng)度太高蛋白質(zhì)易發(fā)生沉淀，也不利于離子交換層析的分離；復(fù)性液溫度不易過(guò)高在4℃－10℃較合適對(duì)于耐熱蛋白也可以室溫復(fù)性。復(fù)性時(shí)間，以天然表達(dá)的重組蛋白復(fù)性應(yīng)在6hr以上，需要進(jìn)行酶切的融和表達(dá)重組蛋白，至少要復(fù)性1hr以上，方可進(jìn)行進(jìn)一步的酶切。 復(fù)性方式：常用的有透析復(fù)性和稀釋復(fù)性。透析復(fù)性適用于小樣品制備；對(duì)于大樣品制備，采用稀釋復(fù)性法簡(jiǎn)便、實(shí)用。一般包含體蛋白的復(fù)性濃度不易過(guò)大，不同的蛋白質(zhì)有所區(qū)別，一般掌握在100－200ug/ml較合適，蛋白濃度太稀使純化流程過(guò)長(zhǎng)，蛋白濃度太濃，蛋白質(zhì)復(fù)性不完全，會(huì)直接影響蛋白的回收率。直接稀釋有困難的，也可以試用分段稀釋法。 蛋白質(zhì)的復(fù)性是重組蛋白純化中最關(guān)鍵和最復(fù)雜的問(wèn)題。蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，所處的環(huán)境不同，使其復(fù)性條件大不相同。任何一個(gè)蛋白質(zhì)都有一個(gè)最佳的復(fù)性條件，這個(gè)最佳條件的選擇是靠大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)完成的。只有選擇到了合適的復(fù)性緩沖液，使蛋白得以正確折疊，才能使進(jìn)一步的層析分離得以順利完成。 |
2樓2011-10-20 13:57:02
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