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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 微生物 » 實驗/技術 » 微生物多樣性研究的幾個問題
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微生物多樣性研究的幾個問題
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1.所有的引物p出來的序列都可以建系統(tǒng)發(fā)育樹嗎 2.什么引物p出來的序列可用于建立基因文庫啊 建立基因文庫怎樣分析哪種是優(yōu)勢菌群 3.連接轉化選擇陽性克隆進行擴增的步驟是什么 謝謝 |
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zhang8826857(金幣+5, MicEPI+1): 不錯，鼓勵新蟲，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
zhang8826857(金幣+5, MicEPI+1): 不錯，鼓勵新蟲，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
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樓主，您好。關于您的問題我有一些見解，建庫有很多種,可以建細菌全基因組文庫，也可以建某功能基因文庫，還可以建16S文庫等......您應該是想建16S文庫做微生物分子生態(tài)吧！如果是統(tǒng)計多樣性，研究群落結構，進化地位和優(yōu)勢種群，建議答案如下： 1），16s適合做系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其進化地位，擴16S全長建議引物27F,1492R.(退火52度，延伸1分30秒)。 2），下面兩個問題其實是一個答案：擴出16S后，酶連至PMD19-T載體，轉化（導入感受態(tài)大腸桿菌種），再用藍白斑篩選（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（陽性）同時轉板，用M13擴增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE膠，分型后，挑取代表克隆子測序構建進化樹。 |
4樓2011-11-09 00:58:27
zhaoyu2881
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2樓2011-11-08 16:21:44
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zhang8826857(金幣+6): 鼓勵新蟲+熱心應助獎勵 2011-11-14 15:56:29
zhang8826857(金幣+6): 鼓勵新蟲+熱心應助獎勵 2011-11-14 15:56:29
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看了你的回帖，我說一下我的實驗，希望你能指導一下。 我就是用的27F和1492R，我做了一次溫度梯度，52度的條帶沒出，46度的還行，沒有特異性。你做連接是跑電泳回收的片段，還是PCR擴出來的直接做連接？我連接了PMD-18，直接涂的AMP平板，菌落長的不多，可能沒弄好，是不是用PMD-19比較好？ 后面的 再用藍白斑篩選（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（陽性）同時轉板，用M13擴增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE膠，分型后，挑取代表克隆子測序構建進化樹。 能在詳細說下么 ？謝謝了 酶切就是分出的條帶不一樣，然后在挑取群落的菌送測么？ |
5樓2011-11-14 12:06:59
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zhang8826857(金幣+5): good 2011-11-15 14:04:02
zhang8826857(金幣+5): good 2011-11-15 14:04:02
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1>大約看了一下你的實驗情況，如果做了降落PCR沒有條帶，可能是起始溫度過高，你可以試試54度。 2>至于52度退火是我們實驗室一直用的，從未出現(xiàn)無法擴增的情況，你還是看看體系有沒有問題。下面是我建議的程序和體系：程序：94度，4分鐘預變性；94度，30秒，變性；52度，30秒，退火；72度，1分30秒，延伸；30循環(huán)，72度，10分鐘，終極延伸；10度，10分鐘，保溫。25微體系：buffer，2.5微；1xdNTP，2.5微；Mg+，2.5微；引物1、2各0.5微；DNA模板0.5~1.0微；Taq酶，0.2微；滅菌水補至25微。 3>如果涂AMP板，載體用PMD19-T和用18-T沒差別，只是藍白斑篩選時19-T高效點。 4>克隆完成后，挑菌做菌落PCR，引物為M13，退火60度，延伸1分40秒。然后用酶切（XSP、Hhal1），跑PAGE，挑不同類型條帶的克隆子測序。 |
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candice_fly6樓2011-11-15 13:16:07
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