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范慧新蟲 (初入文壇)
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[求助]
微生物多樣性研究的幾個問題
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1.所有的引物p出來的序列都可以建系統(tǒng)發(fā)育樹嗎 2.什么引物p出來的序列可用于建立基因文庫啊 建立基因文庫怎樣分析哪種是優(yōu)勢菌群 3.連接轉(zhuǎn)化選擇陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增的步驟是什么 謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857(金幣+5, MicEPI+1): 不錯，鼓勵新蟲，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
zhang8826857(金幣+5, MicEPI+1): 不錯，鼓勵新蟲，加油哦^_^ 2011-11-09 09:05:28
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樓主，您好。關(guān)于您的問題我有一些見解，建庫有很多種,可以建細(xì)菌全基因組文庫，也可以建某功能基因文庫，還可以建16S文庫等......您應(yīng)該是想建16S文庫做微生物分子生態(tài)吧！如果是統(tǒng)計(jì)多樣性，研究群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)化地位和優(yōu)勢種群，建議答案如下： 1），16s適合做系統(tǒng)發(fā)育樹，研究其進(jìn)化地位，擴(kuò)16S全長建議引物27F,1492R.(退火52度，延伸1分30秒)。 2），下面兩個問題其實(shí)是一個答案：擴(kuò)出16S后，酶連至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌種），再用藍(lán)白斑篩選（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（陽性）同時轉(zhuǎn)板，用M13擴(kuò)增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE膠，分型后，挑取代表克隆子測序構(gòu)建進(jìn)化樹。 |
4樓2011-11-09 00:58:27
zhaoyu2881
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2樓2011-11-08 16:21:44
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zhang8826857(金幣+2): good 2011-11-09 09:05:01
zhang8826857(金幣+2): good 2011-11-09 09:05:01
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1.16s、持家基因都可建樹，關(guān)鍵數(shù)據(jù)庫中要有先進(jìn)序列 2.第二個問題前面和第一個問題一樣，關(guān)鍵是你p出來的基因別人也研究過，有較多的相近序列，構(gòu)建文庫后測序，你才能比對，否則自己跟自己比吧，所以要選對基因，你要研究那類微生物，批出來克隆了，測序了或者酶切完了，統(tǒng)計(jì)相同的序列，你就知道哪些是優(yōu)勢菌了 3.選擇載體上的鏈接位點(diǎn)兩側(cè)的序列就可以直接用大腸桿菌煮沸液做模板擴(kuò)增 |
3樓2011-11-09 00:40:06
candice_fly
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zhang8826857(金幣+6): 鼓勵新蟲+熱心應(yīng)助獎勵 2011-11-14 15:56:29
zhang8826857(金幣+6): 鼓勵新蟲+熱心應(yīng)助獎勵 2011-11-14 15:56:29
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看了你的回帖，我說一下我的實(shí)驗(yàn)，希望你能指導(dǎo)一下。 我就是用的27F和1492R，我做了一次溫度梯度，52度的條帶沒出，46度的還行，沒有特異性。你做連接是跑電泳回收的片段，還是PCR擴(kuò)出來的直接做連接？我連接了PMD-18，直接涂的AMP平板，菌落長的不多，可能沒弄好，是不是用PMD-19比較好？ 后面的 再用藍(lán)白斑篩選（涂菌至含X-GEL和AMP的平板），挑取白斑（陽性）同時轉(zhuǎn)板，用M13擴(kuò)增做菌落PCR,酶切分型跑PAGE膠，分型后，挑取代表克隆子測序構(gòu)建進(jìn)化樹。 能在詳細(xì)說下么 ？謝謝了 酶切就是分出的條帶不一樣，然后在挑取群落的菌送測么？ |
5樓2011-11-14 12:06:59
pcl-bunny
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zhang8826857(金幣+5): good 2011-11-15 14:04:02
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1>大約看了一下你的實(shí)驗(yàn)情況，如果做了降落PCR沒有條帶，可能是起始溫度過高，你可以試試54度。 2>至于52度退火是我們實(shí)驗(yàn)室一直用的，從未出現(xiàn)無法擴(kuò)增的情況，你還是看看體系有沒有問題。下面是我建議的程序和體系：程序：94度，4分鐘預(yù)變性；94度，30秒，變性；52度，30秒，退火；72度，1分30秒，延伸；30循環(huán)，72度，10分鐘，終極延伸；10度，10分鐘，保溫。25微體系：buffer，2.5微；1xdNTP，2.5微；Mg+，2.5微；引物1、2各0.5微；DNA模板0.5~1.0微；Taq酶，0.2微；滅菌水補(bǔ)至25微。 3>如果涂AMP板，載體用PMD19-T和用18-T沒差別，只是藍(lán)白斑篩選時19-T高效點(diǎn)。 4>克隆完成后，挑菌做菌落PCR，引物為M13，退火60度，延伸1分40秒。然后用酶切（XSP、Hhal1），跑PAGE，挑不同類型條帶的克隆子測序。 |
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candice_fly6樓2011-11-15 13:16:07
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7樓2011-11-16 09:24:00
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