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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 試劑盒能否在我的實驗中使用
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[求助]
試劑盒能否在我的實驗中使用
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各位前輩，我的實驗第一步是提取DNA，后面要做SSR及同源克隆等，但是由于我提取的是真菌的孢子，存在的問題是孢子量很少，而且孢子破壁很困難。為了解決孢子量少的問題，前一段時間我用了液氮研磨法、液氮加石英砂研磨法、直接CTAB研磨法等使孢子盡量破壁，但是效果都不理想，提到的DNA要么檢測不出來，要么被機械破壞，機械破壞是研磨過程中造成的，可是不盡力研磨的話孢子破不了啊,本來孢子就沒多少。當然有同學跟我說，沒檢測出來的DNA可以直接做PCR的，而且有條帶，可是我不想冒著這樣的風險，最好還是檢測出來比較好。于是實在沒有辦法的情況下，我想試一下試劑盒，可是師姐說試劑盒提的少而且效果不一定好，那么針對我這種材料少到1—5mg的且難破壁的東西來說，試劑盒能提出來嗎？或者說提出來會不會出現(xiàn)沒有條帶之類的情況出現(xiàn)啊！ 番外：主要是破壁困難，孢子的量倒是能夠加大一些到10mg左右~ 求助，小女子在這里跪謝了~ |
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【答案】應助回帖
doudouxiong(金幣+5): 2011-11-03 22:59:12
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主要問題： 1.破壁難（眾所周知孢子破壁難...） 2.樣品量少 針對以上難點，有如下建議： 1.1尋找最優(yōu)化的破碎方法你破碎方法的嘗試很好。至于提到的DNA檢測結果具體怎樣？有電泳圖及OD？注：個人經驗認為，在液氮研磨（不管你是否加石英砂進去）過程是不存在你所說的機械破壞DNA問題的。如果你所提的DNA有降解情況，應該從整個提到過程找原因，如操作劇烈，槍頭沒有鈍化處理等等。液氮加石英砂是個不錯的組合 1.2優(yōu)化裂解體系 不同的樣品適用不同的裂解液。主要有以CTAB及SDS為主的兩大裂解體系，建議可以嘗試一下。另外延長孵育時間（65度）有時也有作用。 1.3可以咨詢或聯(lián)系試劑盒公司的技術支持尋求相關事宜的幫助，現(xiàn)在很多技術支持都很nice的。。。不過的確有像你師姐所說的情況，產量低。但也不排除有些公司的有比較優(yōu)秀的針對孢子的純化試劑盒。 2.1樣品量少這個問題俺就恕莫能助了....千方百計增加多點孢子……^-^ 而且即使10mg孢子所含的DNA也不一定見得有很多。以下只供參考： 一般情況植物新鮮葉片100mgDNA產量5-30ug。（10mg孢子-0.5ug DNA?100ng DNA?又如何能很清楚的被你檢測到呢？） 最后，如果實在沒辦法， 檢測不到直接擴PCR也不失為一個好方法。 |
2樓2011-11-03 11:05:36
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