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小橘子~新蟲 (初入文壇)
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[求助]
求高手解救熒光定量的問題
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最近最熒光定量試驗(yàn)，一直很不順，用的是bioer的試劑，IQ5的機(jī)器。做的是miRNA的相對定量表達(dá)，用的是∆∆CT法，所擴(kuò)增的片段有點(diǎn)大，但在200bp之內(nèi)，出現(xiàn)很奇怪的現(xiàn)象，附上圖： 擴(kuò)增曲線： 溶解曲線： 很是疑惑為什么前面的曲線不平，應(yīng)該不是機(jī)器的問題，因?yàn)槠渌俗鰶]有出現(xiàn)這樣的現(xiàn)象，我把濃度給變大10倍也沒有很好的改觀，求高手指教，非常感謝！ 擴(kuò)增曲線 溶解曲線 溶解曲線的倒數(shù)圖 |
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新蟲 (小有名氣)
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4樓2011-11-24 00:20:34
西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2011-11-06 08:16:04
小橘子~(金幣+1): 非常感謝你認(rèn)真的分析和建議 2011-11-06 10:04:03
wanhscn(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助！ 2011-11-06 08:16:04
小橘子~(金幣+1): 非常感謝你認(rèn)真的分析和建議 2011-11-06 10:04:03
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你說的“前面的曲線不平”是什么意思？ 從你的擴(kuò)增曲線來看，是模板濃度太低了。按照2的N次方擴(kuò)增，模板濃度大10被，Ct值只變小3，10倍還是不夠的。一般情況下，15~20個(gè)循環(huán)左右擴(kuò)增曲線起來比較合適。 你的部分樣品35個(gè)循環(huán)后才有擴(kuò)增，有點(diǎn)夸張……因?yàn)橐话阏J(rèn)為，陰性對照35個(gè)循環(huán)之前沒有擴(kuò)增是正常的…… 雖然這樣子也能定量，但是這么多循環(huán)才有擴(kuò)增，有可能是非特異的擴(kuò)增了，還是想辦法加大模板濃度吧。反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候多加些RNA，可以取試劑盒推薦的RNA用量的上限。 從融解曲線來看，擴(kuò)增還是比較特異的。你的特異的峰有高有低，是因?yàn)镻CR產(chǎn)物還沒達(dá)到飽和（從擴(kuò)展曲線看，離平臺(tái)期還遠(yuǎn)呢）。 綜上，主要的問題，還是模板濃度過低。好在，擴(kuò)增的特異性不錯(cuò)。  |
2樓2011-11-06 00:02:40
3樓2011-11-23 10:40:04
shaquila
金蟲 (正式寫手)
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- 帖子: 553
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- 蟲號: 654839
- 注冊: 2008-11-15
- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
5樓2011-11-24 11:37:57
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