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jiyanhai1988主管區(qū)長
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[求助]
誰有GOT GPT GS 的測定方法啊
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| 誰有測定谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）的測定方法，要詳細(xì)的測定方法。 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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木蟲/panda(金幣+10, 農(nóng)林EPI+1): 感謝您的積極應(yīng)助，歡迎常來農(nóng)林版~ 2011-11-16 22:24:50
jiyanhai1988(金幣+2): 謝謝 2011-11-19 18:50:56
木蟲/panda(金幣+10, 農(nóng)林EPI+1): 感謝您的積極應(yīng)助，歡迎常來農(nóng)林版~ 2011-11-16 22:24:50
jiyanhai1988(金幣+2): 謝謝 2011-11-19 18:50:56
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GOT和GPT我以前測過，GPT方法也有，見下面。如果實驗經(jīng)費不緊張的話，建議用試劑盒測，測起來比較方便。且GOT和GPT的試劑盒價格不貴的，一般用的是南京建成的。 谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（SGPT）測定（King氏法） 原 理 生物體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用是α-氨基酸的氨基通過酶促作用轉(zhuǎn)移到α-酮酸的酮基位置上，生成相應(yīng)的酮酸與氨基酸的化學(xué)反應(yīng)。催化這反應(yīng)的酶稱尾轉(zhuǎn)氨酶，其輔酶為磷酸吡哆醛。轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于存在機體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvic transaminase,GPT）,谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性較高。在正常新陳代謝過程中，血清內(nèi)維持一定水平的轉(zhuǎn)氨酶活性（即正常值）。當(dāng)肝、心、腎等組織發(fā)生病變時，由于組織細(xì)胞腫脹，壞死導(dǎo)致大量的酶釋放至血流中，從而引起血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性顯著升高。因此測定這些酶的活性對某些疾病的臨床診斷具有重要的參考價值。 本實驗用丙氨酸和α-酮戊二酸為底物（基質(zhì)液成分）經(jīng)谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用生成谷氨酸及丙氨酸。丙氨酸與2，4-二硝基苯肼作用生成2，4-二硝基苯腙，此物在堿性條件下呈棕紅色。根據(jù)棕紅色的深淺與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進行比較，即可計算出酶的活性。其反應(yīng)過程如下： King 氏法谷丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性單位：每毫升血清在37℃與PH7.4的基質(zhì)液作用60min，生成1μmol 丙酮酸為一個單位。臨床檢驗取血清量為0.1mL, 報告數(shù)據(jù)以100mL血清計算，因此實際測得結(jié)果乘1000即可。例如0.1mL丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)中丙酮酸含量為0.2μmol,即相當(dāng)GPT200U/100ml血清。 試 劑 與 器 材 一、 樣品 組織液或血清。 二、試劑 1． 甲液（1/15mol/L 磷酸氫二鈉溶液） 稱取磷酸氫二鈉9.47g或含水磷酸氫二鈉23.87g溶于蒸餾水中定容至1000ml. 2. 乙液(1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液) 稱取磷酸二氫鉀9.078g溶于蒸餾水中.定容至1000ml. 取甲液825ml,乙液175ml混合,此液pH應(yīng)為7.4. 3. GPT基質(zhì)液 稱取α-酮戊二酸29.2mg(2m mol/l)及α-DL-丙氨酸1.78g(200 m mol/l) 溶于50mlpH7.4的磷酸緩沖液中,加0.1mol/L NaOH溶液約0.5mL,調(diào)節(jié)pH為7.4,然后加磷酸緩沖液定容至100mL.加少許氯仿防腐,置冰箱中保存. 4. 2,4-二硝基苯肼(1 m mol/L) 稱2,4-二硝基苯肼20mg. 先溶于10mL濃鹽酸中,使其溶解.再以蒸餾水定容至100mL. 5. 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液 精確稱取丙酮酸鈉22mg.加磷酸緩沖液后定容至100 mL.此液濃度為2μmol/mL, 臨用前配置制. 0.4mol/L NaOH溶液,1/15 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.4). 三、 器材 試管及試管架，移液管（0.5mL,1mL,5mL）,量筒(10mL,100mL), 恒溫水浴,722型分光光度計,坐標(biāo)紙. 操 作 方 法 一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線 取12支試管，按下表操作作平行管： 試管編號 試劑處理 空白管 測 定 管 1 2 3 4 5 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液/mL - 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 基質(zhì)液/mL 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 磷酸緩沖液/mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 各管搖勻后,置37℃水浴,保溫10min 2,4-二硝基苯肼/mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 各管搖勻后,置37℃水浴,保溫20min 0.4mol/LNaOH/mL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分搖勻后,在30min內(nèi),520nm波長下比色 相當(dāng)丙酮酸實際含量/μmol - - 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 相當(dāng)GTP單位/100mL血清 - - 100 200 300 400 500 各管光吸收A520值 各測定管減空白A520值差 二、 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以光吸收值為縱坐標(biāo)，酶活性單位為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制各測得A520值與對應(yīng)的酶活性單位數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 三、 樣品及回收率測定 取10支干試管，按下表平行操作： 試管編號 試劑處理 Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)空白管 Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)管 Ⅲ血清空白管 Ⅳ血清管 Ⅴ血清加標(biāo)準(zhǔn)管 血清/mL - - 0.1 0.1 0.05 磷酸緩沖溶液/mL 0.10 - - - - 丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液/Ml - 0.10 - - 0.05 基質(zhì)液/mL - 0.50 - 0.50 0.50 各管搖勻后,置37℃水浴,保溫60min 基質(zhì)液 0.50 - 0.50 - - 2,4-二硝基苯肼/mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 各管搖勻后,置37℃水浴,保溫20min 0.4mol/L NaOH/mL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分搖勻后,在520nm波長下比色,以蒸餾水校正光吸收為零 各管A520值 各測定管減空白A520值差 四、 結(jié)果計算 1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法 根據(jù)樣品管A520值(已減去空白管A520) 查標(biāo)準(zhǔn)曲線,即得每100mL血清中轉(zhuǎn)氨酶活性單位數(shù). 2. 標(biāo)準(zhǔn)管測定法 每次測定酶活性時,同時用丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2μmol/mL)0.1mL,平行操作,即按上表操作,不做標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定A520,按公式計算: 樣品管A520 Ⅳ - Ⅲ 標(biāo)準(zhǔn)管A520 Ⅱ- Ⅰ GPT(U)/100mL 血清= ×200= ×200 用本法測得人血清GTP正常值為91±35.8(U)/100mL血清. 3. 計算回收率 回收率% = 實際測得值(樣品加標(biāo)準(zhǔn)測得值) ×100 理論計算值[（樣品+標(biāo)準(zhǔn)計算值）/2] |
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