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王玉民新蟲 (小有名氣)
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急切求助感受態(tài)制備的問題，請高手指導(dǎo)
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急切求助感受態(tài)制備的問題，請高手指導(dǎo) 這天制備的農(nóng)桿菌和大腸桿菌感受態(tài)都沒結(jié)果，郁悶死了，請高手指導(dǎo)，下面說我做的過程。 農(nóng)桿菌的制備與轉(zhuǎn)化： 菌株：EHA105 過程： 1.用挑取單菌落接種到含有50μg/ml利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)約17h。 3、將培養(yǎng)活化的農(nóng)桿菌按1:50的比例稀釋到50 ml含有50 μg/ml利福平的YEB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)到OD600約0.6。 4. 將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，冰浴30 min。 5、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 6、于4℃，5000 r/min離心10 min，棄上清液，用2 ml 0.05mol/l CaCl2懸浮菌體。 7、每管200 μl分裝，液氮速凍，－70℃保存。 8. 加入4μl質(zhì)粒（約1μg）質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30 min。 3、置液氮中冰凍5min，迅速移入37℃水浴中溫浴5 min，再迅速冰浴2 min，之后加入500 μl液體YEB培養(yǎng)基，于28℃，,200rpm振蕩培養(yǎng)5h。 4、充分活化后的混合物4℃ 5000rpm離心2min，沉淀菌體，棄去上清。 5.用新的YEB培養(yǎng)基重新懸浮菌體后，均勻涂布于含有50mg/l的利福平和75mg/l的SPC(載體抗性）固體培養(yǎng)基上，28度倒置培養(yǎng)24-48h。 大腸桿菌的制備與轉(zhuǎn)化 1.挑單菌落接種于4ml LB 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），于 37℃、250rpm 振蕩培養(yǎng)過夜（約12小時左右）； 2. 取 1ml 過夜培養(yǎng)物按 1::50的稀釋比例轉(zhuǎn)接于50ml LB 液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng) 4 小時，待細菌達到對數(shù)生長期（OD600為 0.5~0.6）； 3. 將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的 50ml 無菌離心管中，置冰上 10 分鐘，使菌液冷卻到0℃。于 4℃、5000rpm 離心 10 分鐘，棄上清； 4.每只離心管加入 10ml 冰冷的 0.1 mol /l無菌 CaCl2將菌體重懸，冰浴放置 10 分鐘，于 4℃、5000rpm 離心 510分鐘，去上清； 5.每只離心管各加入 2ml 冰冷的 0.1 mol/l CaCl2重懸沉淀。 6.液氮速凍 置-70℃保存?zhèn)溆谩?br /> 7.PUC19轉(zhuǎn)化無結(jié)果。 |
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