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[求助]
請教研究農(nóng)桿菌的蟲友
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我現(xiàn)在在做農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，總覺得轉(zhuǎn)化效率太低。我想試著去調(diào)整農(nóng)桿菌的狀態(tài)和濃度。但是，我不知道怎么去確定我所培養(yǎng)的農(nóng)桿菌處于指數(shù)生長期，想請教有經(jīng)驗(yàn)的蟲友。還有農(nóng)桿菌侵染的最佳時(shí)期真的是指數(shù)生長時(shí)期嗎？怎么處理培養(yǎng)好的菌液，收集的菌體要怎樣處理才能更好的保持它的侵染活性？ 如果有相關(guān)的文獻(xiàn)的話，也請蟲友能分享一下。 |
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2樓2011-11-28 09:07:16
瑪格麗特1985
新蟲 (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 124.9
- 帖子: 16
- 在線: 10小時(shí)
- 蟲號(hào): 1491858
- 注冊: 2011-11-14
- 性別: MM
- 專業(yè): 作物分子育種
3樓2011-11-28 23:02:24
【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-11-29 08:49:00
xn712100(金幣+5): 謝謝！您說的這三種菌株我都有做過，個(gè)人覺得ＥＨＡ１０５要好一點(diǎn)。您所說的梯度實(shí)驗(yàn)，我也做過但是效果不明顯。對遺傳轉(zhuǎn)化來說，實(shí)驗(yàn)周期太長。個(gè)人覺得轉(zhuǎn)化時(shí)菌株的狀態(tài)比較重要，想知道怎么判斷菌株的活力水平，以及收集菌體后如何保持它的活力狀態(tài)。希望您不惜賜教！ 2011-11-29 10:05:54
zhang8826857(金幣+1): 鼓勵(lì)交流 2011-11-29 08:49:00
xn712100(金幣+5): 謝謝！您說的這三種菌株我都有做過，個(gè)人覺得ＥＨＡ１０５要好一點(diǎn)。您所說的梯度實(shí)驗(yàn)，我也做過但是效果不明顯。對遺傳轉(zhuǎn)化來說，實(shí)驗(yàn)周期太長。個(gè)人覺得轉(zhuǎn)化時(shí)菌株的狀態(tài)比較重要，想知道怎么判斷菌株的活力水平，以及收集菌體后如何保持它的活力狀態(tài)。希望您不惜賜教！ 2011-11-29 10:05:54
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沒做過這種的，我用過LBA4404、AGL-1、EHA105，不同菌株的最適合OD值是不一樣的，建議從0.6-1.0做一個(gè)梯度試驗(yàn)。轉(zhuǎn)化效率和宿主的狀態(tài)、共孵育條件都有很大關(guān)系，祝好運(yùn)。 |
4樓2011-11-29 08:16:27
5樓2011-11-29 09:01:10
【答案】應(yīng)助回帖
xn712100(金幣+10): 非常感謝！ 2011-11-29 14:24:46
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仔細(xì)看了下，您是做遺傳育種的...大約是做植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的吧。我只做過真菌的，可能差異比較大。 我們的做法是LB培養(yǎng)農(nóng)桿菌48小時(shí)，之后離心，棄上清，轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）重懸，在IM中的初始OD為0.2-0.3，然后28°，120rpm 培養(yǎng)，大約6-8h，OD值到0.8-1.0，然后與真菌孢子共孵育... 我們確定菌株?duì)顟B(tài)的依據(jù)，就是看它在IM中的生長狀態(tài)，如果8h還沒能從0.3長到0.8左右，那么說明這批農(nóng)桿菌的狀態(tài)不佳，基本就是要放棄的。 至于如何保證菌株的活力，我真說不好。對我們而言，就是注意離心的轉(zhuǎn)速不能太高、室溫操作，重懸時(shí)輕柔些。還有，盡量用活化好的農(nóng)桿菌，在LB中的培養(yǎng)時(shí)間也不應(yīng)太長.... 補(bǔ)充一點(diǎn),AS是添加到IM里的，在預(yù)孵育時(shí)就加。 還有一點(diǎn)，農(nóng)桿菌不是萬能的，真的有很多宿主是轉(zhuǎn)不進(jìn)去，或者效率很低的。也有些宿主是比較容易的... 我們以前就用那種特別好轉(zhuǎn)化的宿主，作為陽性對照，檢測這批試驗(yàn)的質(zhì)量。 |
6樓2011-11-29 11:03:11
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