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dreamshaker銅蟲 (正式寫手)
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[求助]
RT-PCR求助
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各位大蝦： 新手上路，請指教啊。最近做RT-PCR，內(nèi)參已經(jīng)調(diào)的差不多了，開始擴(kuò)目的條帶了，但是結(jié)果卻不盡人意，很是焦急啊。主要難題就是擴(kuò)出的條帶弱，而且有引物二聚體的存在，重復(fù)性差。我說的在詳細(xì)一些，目的條帶是300-500bp左右，我用的是退火溫度是55度，35cycles。是不是是退火溫度的原因？還有啊，引物單子上對的Tm值有兩個Tm（1MNa）和Tm（0.05M Na）時的，我應(yīng)該用那一個啊，如何設(shè)計引物的退火溫度啊 ，請各位不吝賜教啊，將很感激啊。 再附上劣圖一張，以圖為參考給出些意見啊。 對于圖片再做些說明，上下兩個目的基因，有點marker（DL2000），5個挨緊的條帶是目的條帶的不同時間處理，就跑成這個樣子了啊，慚愧啊，請各位給點意見。 |
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lvbobo823
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2樓2011-11-24 13:50:26
cjzyfx
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3樓2011-11-24 13:56:38
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4樓2011-11-24 19:20:22
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金幣+5): Good！看樓主的圖似乎是做半定量，直接普通的PCR比較條帶亮度呢。不過，有二聚體確實是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金幣+4): 謝謝你的建議！ 2011-11-25 12:36:14
西瓜(金幣+5): Good！看樓主的圖似乎是做半定量，直接普通的PCR比較條帶亮度呢。不過，有二聚體確實是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金幣+4): 謝謝你的建議！ 2011-11-25 12:36:14
| 退火溫度直接引用你引物軟件設(shè)計上的溫度，引物單上的溫度不一定正確，你的片段貌似長了點，一般在150到200比較好，有引物二聚體應(yīng)該是你的引物質(zhì)量不是很好，如果有時間還是重新設(shè)計一對吧，這個對你后面的實驗非常的重要，另外你可以現(xiàn)在普通上PCR試驗一下，摸索合適的溫度再放到定量PCR上，你說你的重復(fù)性不是很好，根據(jù)我的經(jīng)驗有兩個原因，一個是你的基因如果是低表達(dá)的，你可以適當(dāng)增加模板濃度，另外就是你在加樣的時候操作不一致，不連貫，建議在加樣的時候先寫好一個單子，具體到每個樣加多少，加的順序是什么樣的，盡量在實驗的時候別臨時思考。 |
5樓2011-11-24 21:04:46
dreamshaker
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6樓2011-11-24 22:01:48
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7樓2011-11-24 22:06:20
8樓2011-11-25 12:12:57
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9樓2011-11-25 16:17:40
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