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[求助]
RAPD標(biāo)記有問題，虛心請教。。。。
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條件優(yōu)化結(jié)束，確定體系后，已經(jīng)開始做多態(tài)性了。但做了幾個引物就出問題了，找了很久，也不知道是什么原因，求教高手。 圖1（做的比較好） 圖2 （從某一天開始，所有的多態(tài)性都跟這個差不錯，背景特別亮） 緊急呼救啊。。。  圖2 圖1 [ Last edited by 墨池 on 2011-11-30 at 10:11 ] |
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【答案】應(yīng)助回帖
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amisking(金幣+3, MolEPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-11-30 18:28:57
amisking(金幣+3, MolEPI+1): 鼓勵發(fā)帖交流。 2011-11-30 18:28:57
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RAPD技術(shù)是建立在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，它用一系列(通常數(shù)百個)不同的隨機排列堿基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴增。模板DNA經(jīng)90—94變性 解鏈后在較低溫度(36～37℃)下退火，這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對，在 72℃下，通過鏈延伸，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，完成DNA合成。重復(fù)上述過程，即可產(chǎn)生片段大小不等的擴增產(chǎn)物，通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶，從中 篩選出特征性條帶。擴增產(chǎn)物片段的多態(tài)性反映了基因組DNA的多態(tài)性。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合 位點的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。因此，通過對PCR產(chǎn)物的檢測即可測出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。進(jìn)行 RAPD分析時，可用引物的數(shù)量很大，雖然對每個引物而言，其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基 因組。因此，RAPD可以對整個基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測。 RAPD技術(shù)的優(yōu)點： ①不使用同位素，減少了對工作人員健康的危害； ②可以在物種沒有任何分子生物學(xué)研究 的情況下分析其DNA多態(tài)性； ③對模板 DNA的純度要求不高； ④技術(shù)簡單，無需克隆DNA探針，無需進(jìn)行分子雜交； ⑤靈敏度高，可提供豐富的多態(tài)性； ⑥RAPD引物沒有嚴(yán)格的種屬界限，同一套 引物可以應(yīng)用于任何一種生物的研究，因而具有廣泛性、通用性。 但是，RAPD技術(shù)較易受到各種因素的影響。無論是模板的質(zhì)量和濃度，短的引物序列，PCR的循環(huán)次數(shù)，基因組DNA的復(fù)雜性，技術(shù)設(shè)備等，都有可 能是RAPD技術(shù)重復(fù)性差的直接原因。目前，多從以下幾個方面來提高反應(yīng)的穩(wěn)定性： ①操作規(guī)范，反應(yīng)體系的組成要力求一致，盡可能地使RAPD反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) 化； ②提高擴增片段的分辨率； ③將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記后再進(jìn)行常規(guī)的PCR分析，可以提高反應(yīng)的穩(wěn)定性及可靠性。 |
3樓2011-11-30 10:45:40
2樓2011-11-30 10:43:03
bluysky0902
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5樓2011-11-30 16:44:47
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