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RAPD標(biāo)記有問(wèn)題，虛心請(qǐng)教。。。。
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條件優(yōu)化結(jié)束，確定體系后，已經(jīng)開(kāi)始做多態(tài)性了。但做了幾個(gè)引物就出問(wèn)題了，找了很久，也不知道是什么原因，求教高手。 圖1（做的比較好） 圖2 （從某一天開(kāi)始，所有的多態(tài)性都跟這個(gè)差不錯(cuò)，背景特別亮） 緊急呼救啊。。。  圖2 圖1 [ Last edited by 墨池 on 2011-11-30 at 10:11 ] |
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4樓2011-11-30 10:50:45
2樓2011-11-30 10:43:03
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
amisking(金幣+3, MolEPI+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-11-30 18:28:57
amisking(金幣+3, MolEPI+1): 鼓勵(lì)發(fā)帖交流。 2011-11-30 18:28:57
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RAPD技術(shù)是建立在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，它用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排列堿基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個(gè)bp)作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增。模板DNA經(jīng)90—94變性 解鏈后在較低溫度(36～37℃)下退火，這時(shí)形成的單鏈模板會(huì)有許多位點(diǎn)與引物互補(bǔ)配對(duì)，在 72℃下，通過(guò)鏈延伸，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，完成DNA合成。重復(fù)上述過(guò)程，即可產(chǎn)生片段大小不等的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶，從中 篩選出特征性條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物片段的多態(tài)性反映了基因組DNA的多態(tài)性。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合 位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。因此，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)即可測(cè)出基因組DNA在這些區(qū)域的多態(tài)性。進(jìn)行 RAPD分析時(shí)，可用引物的數(shù)量很大，雖然對(duì)每個(gè)引物而言，其檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基 因組。因此，RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。 RAPD技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)： ①不使用同位素，減少了對(duì)工作人員健康的危害； ②可以在物種沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究 的情況下分析其DNA多態(tài)性； ③對(duì)模板 DNA的純度要求不高； ④技術(shù)簡(jiǎn)單，無(wú)需克隆DNA探針，無(wú)需進(jìn)行分子雜交； ⑤靈敏度高，可提供豐富的多態(tài)性； ⑥RAPD引物沒(méi)有嚴(yán)格的種屬界限，同一套 引物可以應(yīng)用于任何一種生物的研究，因而具有廣泛性、通用性。 但是，RAPD技術(shù)較易受到各種因素的影響。無(wú)論是模板的質(zhì)量和濃度，短的引物序列，PCR的循環(huán)次數(shù)，基因組DNA的復(fù)雜性，技術(shù)設(shè)備等，都有可 能是RAPD技術(shù)重復(fù)性差的直接原因。目前，多從以下幾個(gè)方面來(lái)提高反應(yīng)的穩(wěn)定性： ①操作規(guī)范，反應(yīng)體系的組成要力求一致，盡可能地使RAPD反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn) 化； ②提高擴(kuò)增片段的分辨率； ③將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記后再進(jìn)行常規(guī)的PCR分析，可以提高反應(yīng)的穩(wěn)定性及可靠性。 |
3樓2011-11-30 10:45:40
星晴xinqing
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5樓2011-11-30 16:44:47
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