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西瓜榮譽(yù)版主 (知名作家)
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【轉(zhuǎn)載】研究基因功能的“七大絕招”與“三板斧”--唐凌峰 已有26人參與
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轉(zhuǎn)自科學(xué)網(wǎng)唐凌峰的博客 . 尊重原著，該粗體的地方也加粗了 研究基因功能的“七大絕招”與“三板斧” 唐凌峰 2011.12.6-12.8 生命科學(xué)的研究有很大一部分集中于研究基因及其產(chǎn)物的功能。到底有哪些方法可以用來研究基因功能呢？本文初步總結(jié)為“七大絕招”和“三板斧”。掌握了這“七大絕招”和“三板斧”，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)更容易，看文獻(xiàn)聽學(xué)術(shù)報(bào)告也更輕松。 第一招： 天地人合 無論是學(xué)習(xí)還是研究，必須遵循的一個(gè)原則是“從生活中來，到生活中去”。學(xué)習(xí)的時(shí)候，如果與日常生活中熟悉的、簡單的事情結(jié)合起來理解，就可以化繁為簡，化難為易。學(xué)習(xí)的目的是為了應(yīng)用，學(xué)到的東西，必須應(yīng)用到日常生活中去。 怎樣研究基因的功能？要回答這個(gè)問題，我們先看怎樣研究人的功能。假如你是男生，喜歡上了一個(gè)“女生”，可是這個(gè)“女生”長得撲朔迷離，帥氣中帶著嫵媚，羞澀中透出豪爽。所以，你面臨的第一個(gè)問題就是：TA到底是男還是女？第二個(gè)問題是：TA是不是學(xué)生？如果是的話，是本校的嗎？你不認(rèn)識TA的任何朋友，所以也沒法打聽。為了回答這幾個(gè)問題，你決定翹課跟蹤TA。你發(fā)現(xiàn)，白天的大多數(shù)時(shí)間，TA去了本校教學(xué)樓的教室。你守在教室的洗手間旁邊，觀察TA下課的時(shí)候上洗手間，去的是男洗手間還是女洗手間。高興的是，你發(fā)現(xiàn)TA去了女洗手間（終于松了一口氣）。不過你比較小心，為防萬一，你又跟蹤她，看她晚上回宿舍去的是男生宿舍還是女生宿舍。不出所料，她去了本校的女生宿舍。這下你終于放心了：她是本校的一個(gè)女生。 因?yàn)樗ヅ词珠g和女生宿舍，提示她是女的。因?yàn)樗滋烊ケ拘＝淌�，晚上去本校女生宿舍，提示她是本校女生。上述事例告訴我們：一個(gè)人什么時(shí)候，在哪里活動(dòng)可以提示其身份。同樣，基因表達(dá)的時(shí)間和部位，常�？梢蕴崾酒涔δ� 。例如，如果基因A在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，成年后不表達(dá)，則提示該基因與發(fā)育有關(guān)�；駼在在大腦的海馬中表達(dá)，而海馬與記憶有關(guān)，那么這個(gè)基因可能與記憶有關(guān)。 接下來的問題就是：她是哪個(gè)系的？她有什么興趣愛好？你發(fā)現(xiàn)，她有兩個(gè)個(gè)形影不離的好朋友。你恰好有同學(xué)認(rèn)識她的這兩個(gè)朋友。同學(xué)告訴你：她兩個(gè)好朋友都是中文系的，都喜歡打羽毛球。這時(shí)，你基本上就可以認(rèn)為這個(gè)女生是中文系的，愛好之一是羽毛球了。 以上所述可以歸納為三點(diǎn)：天時(shí)，地利，人和。“天時(shí)”指基因及其產(chǎn)物什么時(shí)候表達(dá)，“地利”指的是基因及其產(chǎn)物表達(dá)于哪個(gè)部位�！叭撕汀笨梢赃M(jìn)一步引申為兩點(diǎn)：1. 近朱者赤，近墨者黑。就是說一個(gè)人會(huì)與他經(jīng)常接近的人相似。基因也是如此，相互作用的一些基因常常具有類似的功能，它們?yōu)榱送瓿赏粋�(gè)功能而通力合作。例如，如果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白C與蛋白D相互結(jié)合，而基因D是某一信號通路的受體，則基因C可能也是該信號通路的成員。2. 近豬者吃，近墨者喝。就是說一個(gè)人不僅會(huì)經(jīng)常接觸與自己類似的人，還經(jīng)常接觸自己的工作對象。例如，一個(gè)經(jīng)常與學(xué)生接觸的人，既可能是學(xué)生（近朱者赤），也可能是老師（近豬者吃）。同理，與一個(gè)基因接觸的其它基因或者物質(zhì)，也可能是其作用的對象。例如，如果蛋白質(zhì)F與DNA結(jié)合在一起，則提示其對DNA發(fā)揮作用，可能參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等。 “合”指的是合理。億萬年的進(jìn)化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表現(xiàn)就是能夠促進(jìn)個(gè)體的生存和繁衍。合理遵循兩個(gè)原則：一，經(jīng)濟(jì)原則。生物不會(huì)浪費(fèi)物質(zhì)和能量在一個(gè)無用或者冗余的基因上。凡是一個(gè)基因可以實(shí)現(xiàn)的功能，沒有必要用兩個(gè)基因。二，有效原則�；虻墓δ軕�(yīng)該促進(jìn)而不是損害生物的生存和繁衍。根據(jù)合理性原則，無需任何實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們不難想到非編碼DNA序列是有用的，不是無用的垃圾。 第二招：患得患失 有人說，金錢不是萬能的，但是沒有金錢是萬萬不能的。那么，金錢到底有什么作用呢？有兩種方法可以知道答案。第一種方法是你去一個(gè)陌生的地方，突然錢包被偷，所有的現(xiàn)金、信用卡和可以換錢用的物品都沒有了。此時(shí)，你就知道錢的作用是什么了。第二種情況是你買彩票突然中了一千萬，很快，你也可以知道錢的作用是什么。得到和失去，都可以讓我們知道事物和人物的功能，而其中失去更為有效。 得，指的是基因的過表達(dá)（Overexpression）；失，指的是基因敲除（Knockout）或者低表達(dá)（Under-expression）。例如研究的假說是基因A與記憶力呈正相關(guān)，那么可以這樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：先過表達(dá)基因A，預(yù)期結(jié)果是記憶力增強(qiáng)，再降低基因A的表達(dá)水平，或者完全敲除（如果不是lethal的話），預(yù)期結(jié)果是記憶力減弱。一個(gè)高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，一般應(yīng)該“患得患失”，兩方面的實(shí)驗(yàn)都要做。 我們不僅要“患得患失”，還要“斤斤計(jì)較”。因?yàn)檫^表達(dá)或低表達(dá)的水平不同，表型改變可能也不同，甚至看不到表型改變。例如，用RNAi Knockdown一個(gè)基因的表達(dá)水平的70%也許看不到任何變化，但是Knockdown 90%就能觀察到表型改變了。所以，當(dāng)過表達(dá)或者低表達(dá)研究基因卻沒有得到預(yù)期結(jié)果的時(shí)候，就需要考慮基因表達(dá)水平的變化是否不足。 有時(shí)即使完全敲除一個(gè)基因也看不到任何表型的改變，此時(shí)也不能下“研究基因與研究表型無關(guān)”的結(jié)論。這就好比一個(gè)橋有十個(gè)橋墩，如果只去除掉橋墩4，在非過負(fù)荷的情況下，橋可能不會(huì)倒塌，可以正常通車�？墒�，如果先去除掉橋墩5，再去除橋墩4，橋就會(huì)倒塌了。我們能夠認(rèn)為橋墩4是無用的嗎？當(dāng)然不能。橋墩在這里好比處于同一個(gè)通路具有相似功能的基因，橋是否可以通車好比基因的表型是否正常。所以，在敲除一個(gè)基因A看不到表型改變的情況下，可以在基因B（與A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的動(dòng)物模型上敲除基因A，觀察敲除后是否有變化。 有時(shí)候，全身性的過表達(dá)、低表達(dá)或者基因敲除會(huì)出現(xiàn)我們不想要的結(jié)果。例如，全身性的基因敲除會(huì)致命。為了解決這個(gè)問題，現(xiàn)已開發(fā)出許多種組織特異性和時(shí)間特異性的過表達(dá)、低表達(dá)和基因敲除技術(shù)，使得基因調(diào)控更加準(zhǔn)確。 第三招：上下求索 基因需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄為RNA、翻譯為蛋白質(zhì)至少兩步才能發(fā)揮功能。所以，研究一個(gè)基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)的水平分別進(jìn)行研究。DNA的水平相同，不代表RNA的水平相同；同樣，RNA的水平相同，不代表在蛋白質(zhì)的水平相同。哪怕就是在RNA水平，還有不同的剪切的可能。 一個(gè)基因翻譯成蛋白質(zhì)之后，常常需要同其它的基因及其產(chǎn)物相互作用才能發(fā)揮功能。例如基因S，翻譯成蛋白質(zhì)S，如果它是配體，就需要和受體結(jié)合，然后受體激活信號通路。如果S鑒定出來了而其余的通路基因沒有鑒定出來，那就可以研究上游的配體和下游的信號通路基因分別是什么。一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，常�？梢约せ罨蛞种埔幌盗谢虻谋磉_(dá)，究竟可以控制哪些下游基因，也值得研究。蛋白質(zhì)發(fā)揮功能，常常會(huì)有正性調(diào)控和負(fù)性調(diào)控因子。從上游來看，哪些基因及其產(chǎn)物可以促進(jìn)或抑制研究基因的表達(dá)水平？具體機(jī)制是怎樣的？從下游來看，哪些基因及其產(chǎn)物可以增強(qiáng)或者減弱研究基因的功能？具體機(jī)制是怎樣的？這些都可以研究。 所以，研究一個(gè)基因，就可以在不同的表達(dá)水平和不同的作用水平上“上下求索”。 第四招：背井離鄉(xiāng) 背井離鄉(xiāng)，指的是misexpression，就是在非正常時(shí)間、非正常位置、非正常物種（時(shí)間、地點(diǎn)、人物）表達(dá)一個(gè)基因。如果在正常情況下，研究基因具有特定功能，而且在非正常時(shí)間、非正常位置和非正常物種間表達(dá)的時(shí)候同樣導(dǎo)致該功能，則我們下“該基因具有該特定功能”的結(jié)論就更有把握。 值得注意的是，misexpression不產(chǎn)生預(yù)期表型，并不能認(rèn)為研究基因與該表型無關(guān)。因?yàn)橐粋�(gè)基因發(fā)揮作用，需要很多其它基因的幫助。如果misexpression的部位、時(shí)間、物種缺乏該基因發(fā)揮功能需要的輔助基因，或者多了可以抑制該基因功能的其它基因的表達(dá)，則可以導(dǎo)致預(yù)期表型無法產(chǎn)生。如果misexpression產(chǎn)生了某一表型，不代表該表型是該基因的正常功能，原因同上。所以，misexpression告訴我們：該基因“可以”做什么，不代表該基因?qū)嶋H上做了什么。打個(gè)比方，我們把一個(gè)教授放到農(nóng)村去，他沒法接觸到做科研需要的設(shè)備、文獻(xiàn)等，而且迫于生計(jì)，他不得不自己種田維持生存。我們能夠下結(jié)論說：教授的社會(huì)職能是種田嗎？當(dāng)然不可以。但是我們可以說：教授是“可以”種田的。 第五招：內(nèi)外兼修 體外實(shí)驗(yàn)（In vitro）簡單便捷，可以很快得到結(jié)果�？墒�，體外實(shí)驗(yàn)的條件和體內(nèi)的情況不一樣，體外實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果一般還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（In vivo）來驗(yàn)證�！皟�(nèi)外兼修”指的是既做體外實(shí)驗(yàn)， 又做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。這一招不是太常見，有些文章不一定同時(shí)做體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)。 第六招：十面埋伏 當(dāng)你論證一個(gè)觀點(diǎn)的時(shí)候，可能會(huì)有人反駁你。一篇好的文章，必須提前想到這些反駁，并通過做相應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)下“埋伏”，反駁這些可能的反駁；此外，還應(yīng)通過類似實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證來增加結(jié)論的可靠性，這就叫做“十面埋伏”。 中醫(yī)診治病人，需要“望聞問切”，把四種方法得到的信息綜合起來才能做出正確的診斷，這叫“四診合參”。（題外話：電視劇里僅僅通過望診或者僅僅把脈就開藥的中醫(yī)，基本上都是騙人的。實(shí)際生活中遇到這樣的中醫(yī)，可以判斷為江湖游醫(yī)。）歷史學(xué)上有一個(gè)說法叫做“孤證不立”，就是說如果只有一條證據(jù)支持一個(gè)論點(diǎn)，那么這個(gè)論點(diǎn)是不可靠的。生活中，如果有一個(gè)人說某人有問題，他不一定真的有問題。可是如果很多人都說他有問題，那他就很可能真的有問題了。 如果僅僅從一篇文章的角度來考慮，做這么多的實(shí)驗(yàn)不是很有必要。例如，做了第一個(gè)實(shí)驗(yàn)，結(jié)論成立的可能性是80%，做了第二個(gè)，可能性上升到95%�？墒牵蒲惺欠e累性的，你的結(jié)論是別人推理的基礎(chǔ)，你推理的基礎(chǔ)則是前人的結(jié)論。假如A1引用了你的文章，A2又引用了A1的文章，如此反復(fù)一直到A10。如果每篇文章結(jié)論正確的概率是80%，則A10文章結(jié)論正確的概率是0.8010=10%，如果每篇文章結(jié)論正確的概率是95%，則A10文章結(jié)論正確的概率是0.9510=60%。差別從一開始的15%，變成6倍了。所以，多做實(shí)驗(yàn)增加結(jié)論的可靠性，對于科學(xué)的長期發(fā)展是至關(guān)重要的。 看文獻(xiàn)的時(shí)候，你會(huì)發(fā)現(xiàn)作者做了一大堆實(shí)驗(yàn)，這么多的實(shí)驗(yàn)就像唐僧在你耳邊念經(jīng)一樣，把你弄得暈頭轉(zhuǎn)向。為了提高看文獻(xiàn)的效率，一般只看關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，次要的實(shí)驗(yàn)可以略過。當(dāng)你做學(xué)術(shù)報(bào)告時(shí)，由于時(shí)間有限，只報(bào)告關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。等到觀眾提問時(shí)，這些次要實(shí)驗(yàn)就可以派上用場了。例如，聽完你的報(bào)告，有聽眾提問說：“我覺得你的結(jié)果還有兩種可能的解釋，包括。。。你怎樣得出這個(gè)結(jié)論的呢？”此時(shí)，你就可以從容自若的說：“這是一個(gè)很好的問題。針對第一種可能，我們做了XX實(shí)驗(yàn)，結(jié)論不支持這個(gè)可能。針對第二種可能，我們做了XX實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)。。�！� 看到了吧？這就是“十面埋伏”的妙處。 第七招：一網(wǎng)打盡 如上所述，每一個(gè)基因都有作用于它的上游基因，也有受它作用的下游基因。每一個(gè)上游基因和下游基因又分別有自己的上下游基因。除了上下游基因及其產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)、機(jī)體內(nèi)的其它物質(zhì)例如離子等也都會(huì)作用于基因自身。用馬哲的觀點(diǎn)來說就是聯(lián)系無處不在，無時(shí)不有。這些聯(lián)系構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。目前生命科學(xué)的一個(gè)發(fā)展趨勢就是研究基因網(wǎng)絡(luò)。所以，研究一個(gè)基因的功能，還可以構(gòu)建出它所處的網(wǎng)絡(luò)。 科研中的例子： 為了說明上述方法的應(yīng)用，我們可以看一篇發(fā)表于PNAS 2011年5月的文獻(xiàn)。文章鏈接：http://www.pnas.org/content/108/19/8059.short 本文思路簡單，用到上述“七大絕招”中的三招：天地人和：作者首先通過原位雜交和免疫染色發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路表達(dá)于果蠅的大腦中的蘑菇體。因?yàn)槟⒐襟w是果蠅嗅覺記憶中樞，所以作者推測JAK/STAT信號通路與果蠅的記憶有關(guān)�；嫉没际В喝缓笸ㄟ^不同的手段抑制JAK/STAT信號通路的活性，發(fā)現(xiàn)果蠅長期記憶受損。最后，作者得出結(jié)論：JAK/STAT信號通路是果蠅長期記憶形成所必須的。十面埋伏：在每一個(gè)階段，作者都做了大量的實(shí)驗(yàn)來支持一個(gè)觀點(diǎn)。例如為了說明JAK/STAT信號通路在蘑菇體有活性，作者首先用原位雜交的方法檢測了該信號通路的總共5個(gè)基因中的4個(gè)；然后又用免疫染色的方法檢測了5個(gè)基因中的3個(gè)，最后還用一種叫做enhance trap的方法檢測了5個(gè)基因中的1個(gè)。一個(gè)8個(gè)實(shí)驗(yàn)，個(gè)個(gè)都表明JAK/STAT信號通路表達(dá)于果蠅蘑菇體（真夠煩人的要不是為了寫這篇博文，我都懶得看）） 生活中的例子： 一切道理都是相通的。本文所說的方法不僅適用于研究基因功能，還適用于研究其它物質(zhì)和事物的功能，例如激素、藥物、療法等。除了適用于科研，還適用于日常生活。舉例來說，假如我們想知道黑社會(huì)對社會(huì)有什么影響，就可以：天地人和：調(diào)查黑社會(huì)活動(dòng)的時(shí)間和地點(diǎn)，經(jīng)常接觸的人物�；嫉没际В虹P除黑社會(huì)，看社會(huì)有何變化；增加黑社會(huì)的規(guī)模，看社會(huì)又有什么變化。上下求索：看看上面有哪些人是黑社會(huì)的保護(hù)傘，下面有哪些人是黑社會(huì)的衣食父母和后備軍。背井離鄉(xiāng)：把黑社會(huì)從我國趕到鄰近國家，看對他們有何影響。十面埋伏：必須多方查證，例如敲詐勒索一起還不夠，要敲詐勒索幾百起，行賄受賄數(shù)十人，黃賭毒一應(yīng)俱全，橫行鄉(xiāng)里，無惡不作，才可以充分證明黑社會(huì)的危害性。一網(wǎng)打盡：從政治、經(jīng)濟(jì)、文化、教育等社會(huì)各方面看黑社會(huì)與其有何聯(lián)系。 三板斧：天時(shí)地利，患得患失，十面埋伏 為了增加適用范圍，上面一共總結(jié)出了七大絕招，但卻不夠簡練。一個(gè)研究或者一篇文章，常常只用到其中的一部分。為了更加簡潔，可以總結(jié)為最重要的“三板斧”：天時(shí)地利，患得患失，十面埋伏。“天時(shí)地利”，指的是基因何時(shí)何地表達(dá)�！盎嫉没际А�，其中“患失”比“患得”重要得多�！笆媛穹�，指的是立體論證。基本上，每一個(gè)研究都離不開這三板斧，上述文章就是一個(gè)很好的例子。而只要學(xué)會(huì)這三板斧，就可以做大部分科研了。所以，科研就是這么簡單！ （說明：本文是對大約一年前的博文《研究基因功能的“四大絕招”（初步總結(jié)版）》的修改和補(bǔ)充。本文仍存在繼續(xù)修改的可能） [ Last edited by 西瓜 on 2011-12-9 at 22:44 ] |
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