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[求助]
基因組DNA提取問題
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大家好，我是做真菌研究的，在提取基因組DNA時(shí)遇到一個(gè)問題，能力有限，實(shí)在是解決不了，可是實(shí)驗(yàn)不能等啊，請(qǐng)有經(jīng)驗(yàn)，有能力的蟲友幫我解決一下，謝謝了��！ 我是用液氮研磨菌絲，氯化芐法提取的DNA，提取完之后用200 uL TE buffer溶解（完全溶解）然后用10 uLRNA酶消化過夜，結(jié)果跑電泳（見圖一），然后我又用TE buffer 稀釋5倍后，再跑電泳，結(jié)果（見圖二），后面加大了RNA酶的量，還是同樣出現(xiàn)這種情況，無語了，請(qǐng)問這是為什么？ 我的問題是：DNA用TE 完全溶解后（肉眼觀察是完全溶解了的）跑電泳，上面沒有目的條帶，下面有一團(tuán)亮帶，再用TE稀釋5倍后，結(jié)果上面出現(xiàn)了很明顯的目的條帶，下面就基本上沒有了，請(qǐng)問這是為什么？？ 圖一 圖二 [ Last edited by 1949stone on 2011-12-14 at 11:33 ] |
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| 我提取時(shí)剛開始也出現(xiàn)過這樣的問題，我覺得（1）盡量不要使用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，這時(shí)候RNA含量較多。（2）液氮研磨確實(shí)能很好地防止降解，個(gè)人覺得DNase比較脆弱，并且其活性需要二價(jià)陽離子，所以在提取DNA時(shí)一般要加入EDTA，因此在加入足量的EDTA（10-50mM）條件下，DNA一般不會(huì)降解（個(gè)人體會(huì)），所以提取過程其實(shí)沒必要保持很低溫度，相反較高的溫度可以降解掉RNA，對(duì)你的提取有利，但是盡量減少剪切，振蕩溫和點(diǎn)，槍頭剪掉前面部分等。（3）RNase可以在研磨時(shí)就加進(jìn)去，增加消化的時(shí)間，沉淀溶解時(shí)，不要太濃，體系可以大一點(diǎn)，加入RNase酶消化，效果比較好，消化時(shí)可以使用50度，一般半小時(shí)以內(nèi)就可以消化殆盡，這時(shí)可以再用酚氯仿再抽提一次，去除蛋白。個(gè)人體會(huì)，不對(duì)之處請(qǐng)指出。 |
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16樓2011-12-14 18:46:33
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