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wapw1987新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
gst標(biāo)簽蛋白的表達(dá)和純化
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| 有沒(méi)有高人做過(guò)GST標(biāo)簽的蛋白的表達(dá)和純化，能不能給點(diǎn)建議，我用的是pGEX質(zhì)粒，需要在什么菌株中表達(dá)，純化時(shí)用什么方法收集提純呢？ |
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 蛋白質(zhì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn) |
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xhjggl
木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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3樓2011-12-24 21:17:50
Dionysius
木蟲(chóng) (小有名氣)
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2樓2011-12-24 10:14:02
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
wapw1987: 回帖置頂 2011-12-25 15:12:27
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linyingjia(金幣+5, BioEPI+1, 專(zhuān)家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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linyingjia(金幣+5, BioEPI+1, 專(zhuān)家考核): 很好 2011-12-27 20:30:24
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1. 轉(zhuǎn)8ml過(guò)夜小搖菌液接入800ml含氨芐的LB培養(yǎng)基（2L錐形瓶）, 37度搖菌至OD600至 0.6。 2. 誘導(dǎo)前取1ml菌液，也可使用轉(zhuǎn)入其它質(zhì)粒的未誘導(dǎo)的BI21菌株作對(duì)照。 這是沒(méi)有誘導(dǎo)的對(duì)照，5000rpm，5min去上清，菌體用50 μl SDS loading buffer重懸，放置于－20度備用。 3. 加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，使其中濃度達(dá)0.1mM。 4. 室溫誘導(dǎo)過(guò)夜（8小時(shí)左右），取1ml菌液。 這是誘導(dǎo)后的對(duì)照，5000rpm，5min去上清，菌體用100μl SDS loading buffer重懸，放置于－20度備用。 5. 使用冷凍離心機(jī)4000g，4度離心20分鐘，去上清。（除去LB培養(yǎng)基） 6. 將-20度保存的菌體放在冰上15min，用lysis buffer重懸。（1g菌體用2到5ml lysis buffer） 7. 加溶菌酶，使其終濃度達(dá)1mg/ml，放置于冰上30min。 8. 超聲破碎細(xì)胞（冰上進(jìn)行），工作2s停1s，60s每循環(huán)，重復(fù)四次。 9. 10000g，4度離心30min。 11. 從上清中取出20μl，加5μl SDS loading buffer，放置于－20度備用。 Beads的預(yù)處理： 1） 將600μl 50％的Ni-NTA slurry/ Glutation Sepharose 4B加入層析柱，打開(kāi)底部的的蓋子，除去酒精。 2） 4ml 無(wú)菌水洗柱3－4次（間隔：4度 rotate10min） 3） Lysis buffer 洗柱2次（同上） 12. 將剩余裂解液加0.3ml beads，4度冰箱rotate 2hr。 13. 裝柱 14. 用4ml Wash buffer洗beads（目的是洗掉非特異吸附），4度冰箱rotate 10min，重復(fù)洗四次，最后一次離心留少許上清。（因?yàn)橛锌赡躡eads對(duì)融合蛋白的結(jié)合不強(qiáng)，所以每一步都保留上清） 每次洗脫都要取20 μl，加5μl 5*SDS loading buffer。放置于－20度備用。 15. 使用300μl Elution buffer洗柱（可根據(jù)情況，適量增加洗脫體積），4度冰箱rotate 10min，重復(fù)洗四次，每次都用一個(gè)EP管接收。分析每次洗脫的蛋白量，實(shí)驗(yàn)要在冰上進(jìn)行。 每次洗脫都要取5μl，加5μl 2*SDS loading buffer，放置于－20度備用。 16. 10％SDS PAGE檢測(cè)。 17. 檢測(cè)蛋白濃度 |
4樓2011-12-25 01:02:41
5樓2011-12-25 01:05:15
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