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夢寒南開新蟲 (初入文壇)
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[求助]
粘性末端克隆無目的片段
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BamH1酶切得到目的片段約為100bp，膠回收；puc19載體經(jīng)過BamH1單酶切，去磷酸化處理，膠回收；然后連接轉(zhuǎn)化，藍白斑篩選，取陽性克隆鑒定！ 1.M13pcr P不出目的條帶； 2.提取質(zhì)粒酶切也切不出目的片段； 可是為什么會有那么多白斑呢？哎，哪一步最可能出現(xiàn)問題呀，謝謝大家！ ps簡單的步驟 1.提取puc19，Bamh1酶切，去磷酸化，膠回收 2.克隆提取質(zhì)粒，酶切，膠回收 3連接反應(yīng) 片段，載體按么人比1/10混合，65度5min，冰浴3min，加入buffer，T4酶，連接16h、16度 4轉(zhuǎn)化 正常轉(zhuǎn)化 可能的問題（自己想到的）： 1.第一步提取PUC19時忘了加AMP，有雜菌？可是提出質(zhì)粒大小合適呀？ 2.由于載體酶切之后要膠回收，所以切了20ug，難道直接沒有切開，跑電泳檢測的時候，切過和沒切過的有差別的，不過差別不是很大？ 3.最后檢測的時候由于片段太小，載體太大，電泳檢測不出來？ 4.M13引物不是一個公司的？不太可能，我M13引物在puc19全序列比對過，酶切位點在二者之間 5.PUC19是T載體中陽性對照的puc19DNA，重新轉(zhuǎn)化養(yǎng)起來提的質(zhì)粒，做載體用的，難道是這一步有問題，不知道當時怎么想的，突然就這樣做了，哎！ 謝謝大家了哈！  |
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