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[交流]
新提的質(zhì)粒DNA，關(guān)于濃度和純度蟲友們發(fā)表一些看法吧
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質(zhì)粒名稱 濃度（ng/μL） A260/280 A260/230 質(zhì)粒1 24 1.97 1.17 質(zhì)粒2 47.4 1.93 1.56 質(zhì)粒3 41.8 1.98 1.50 以上是今天提取的質(zhì)粒的相關(guān)測定指標(biāo)，請大家據(jù)此數(shù)據(jù)幫忙分析一下！個人感覺數(shù)值很不理想！提取的很不成功！ |
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西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！辛苦！ 2012-01-08 16:58:17
lihengyang86(金幣+3): PET42a大小為5930bp，插入片段也就680bp左右。屬不屬于嚴(yán)緊型質(zhì)粒倒不是很清楚。多謝您的關(guān)注和建議。 2012-01-08 18:15:05
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西瓜(金幣+5, MolEPI+1): Good！辛苦！ 2012-01-08 16:58:17
lihengyang86(金幣+3): PET42a大小為5930bp，插入片段也就680bp左右。屬不屬于嚴(yán)緊型質(zhì)粒倒不是很清楚。多謝您的關(guān)注和建議。 2012-01-08 18:15:05
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4ml 菌只拿到了不到4ug的質(zhì)粒～ PET42a 6k? 插入片段多大？整個質(zhì)粒多大？屬于低拷貝不？ 如果屬于低拷貝，這個產(chǎn)量也說得過去。 有兩種思路： 1）你用同樣的操作及kit 提一個正常（高拷貝的質(zhì)粒）的菌液，看產(chǎn)量是否有問題，如沒問題則說明你的菌“有問題”（：本身質(zhì)粒的拷貝數(shù)低問題） 2）如果是本身菌質(zhì)粒拷貝數(shù)低的問題，則另想解決辦法：如優(yōu)化搖菌時間，用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，培養(yǎng)提取時的菌液用量或直接中提等等。 |
13樓2012-01-08 16:18:36
ganchao1776
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lihengyang86(金幣+2): 學(xué)習(xí)了！多謝！ 2012-01-11 19:39:22
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): Good！ 2012-01-13 11:43:24
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lihengyang86(金幣+2): 學(xué)習(xí)了！多謝！ 2012-01-11 19:39:22
西瓜(金幣+3, MolEPI+1): Good！ 2012-01-13 11:43:24
| 小體系（20ml以下）里是沒有關(guān)系的，大系A(chǔ)600高了就不行了，這主要與溶氧和營養(yǎng)有關(guān)；比如說3ml的體系，比表面積足夠大，對LB的營養(yǎng)來說A600達(dá)到最大也能滿足溶氧需求，但是對于200ml的體系情況就大不一樣，即要保證營養(yǎng)，又要保證溶氧，DNA的合成需要消耗大里的能量，質(zhì)粒擴增也需要壓力，上面所有原因的集合，就是前面摸出來的條件，不同的質(zhì)粒會略有不同，但是不會超出這個范圍 |
20樓2012-01-11 18:00:30
ganchao1776
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應(yīng)用范圍來說，主要看你的需要了，如果你要20ug以下，小提的量就足夠了，100ug以下，你可以小提多提幾個，也很快的，如果不超過200ug或200ug左右，估計一個中提的量也夠了，800ug以上，那只有大提了。另外也要看你所需要質(zhì)粒的質(zhì)量了，沒有特殊要求，普通的試劑盒就可以，如果鹽要少，那提的時候就要多洗兩次，如果要去內(nèi)毒素，就要用去內(nèi)毒素的試劑盒。 影響大提所提質(zhì)粒的量主要跟菌體培養(yǎng)、所用試劑盒和質(zhì)粒提取的操方有關(guān)；菌體的用量是在試劑盒允許的范圍內(nèi)越多越好，當(dāng)然了，高考貝質(zhì)粒的話，可能用一半的菌體量所得的質(zhì)粒就會超出柱子的承載能力，就沒有必要培養(yǎng)那么多菌了；現(xiàn)在很多的試劑盒的說明書都不是最優(yōu)的操作方法，完全可以大膽的改進(jìn) |
30樓2012-04-12 09:46:35
2樓2012-01-08 07:59:19
3樓2012-01-08 08:00:06
5樓2012-01-08 09:46:31
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9樓2012-01-08 11:23:36
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12樓2012-01-08 14:22:27
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16樓2012-01-09 10:27:23
17樓2012-01-09 16:56:39
ganchao1776
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西瓜(金幣+2): 鼓勵交流。1.78,1.93，這么精確啊 2012-01-09 17:53:45
lihengyang86(金幣+2): 那要是這樣的話，我提的效率很低了 ！4mL菌液才提了不到4μg！請問你搖菌大概多長時間？！ 2012-01-10 14:49:12
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西瓜(金幣+2): 鼓勵交流。1.78,1.93，這么精確啊 2012-01-09 17:53:45
lihengyang86(金幣+2): 那要是這樣的話，我提的效率很低了 ！4mL菌液才提了不到4μg！請問你搖菌大概多長時間？！ 2012-01-10 14:49:12
| 康為的試劑盒還是不錯的；對于低拷貝數(shù)很低的質(zhì)粒，每ml菌液至少也能提個3到4ug質(zhì)粒的，對于所提取質(zhì)粒的質(zhì)量，A260/A230的值在1.85左右是最好的，低于1.78高于1.93對細(xì)胞轉(zhuǎn)化都會有影響，要是酶切或轉(zhuǎn)化大腸的話，可能沒有什么影響吧。質(zhì)粒提取的關(guān)鍵在菌體的培養(yǎng)，一般培養(yǎng)到菌液A600在2.0左右為最好，高于2.5會影響質(zhì)粒的拷貝數(shù)，低于1.5所收的菌量太少。 |
18樓2012-01-09 17:36:13
ganchao1776
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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+1): 感謝積極交流哦 2012-01-11 08:19:16
lihengyang86(金幣+2): 謝謝！我就是小提！另外，想請問為啥提質(zhì)粒時，不是A值越高越好？！ 2012-01-11 16:19:18
小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖
小丹木木(金幣+1): 感謝積極交流哦 2012-01-11 08:19:16
lihengyang86(金幣+2): 謝謝！我就是小提！另外，想請問為啥提質(zhì)粒時，不是A值越高越好？！ 2012-01-11 16:19:18
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因為我提的質(zhì)粒沒有超出這個范圍的，轉(zhuǎn)化細(xì)胞都很好，有同事提的超出了這個范圍，出了些意外，但是不能確定是不是質(zhì)粒的問題，但是沒有找到其它原因，所以就都當(dāng)是這個的原因了。 如果你是小提的話，單菌落接3ml的LB37度過液就沒有問題的，如果你是中提或大提的話，種子長到A600 1.2左右，200ml/50ml培養(yǎng)基，接20ul，搖床180rpm，過夜，大概長到1.8左右吧，這樣就可以了 |
19樓2012-01-10 23:54:31
21樓2012-01-11 18:38:35
22樓2012-01-12 10:26:44
23樓2012-01-12 11:48:28
24樓2012-01-12 14:00:19
25樓2012-01-12 14:25:59
26樓2012-01-12 14:27:36
濃度偏低，不過酶切可以檢測到，回收的話，有點不合適 27樓2012-01-12 15:46:26
28樓2012-01-13 10:49:56
29樓2012-04-11 13:16:36
31樓2012-08-13 16:08:59
32樓2012-10-23 19:28:50
33樓2014-09-28 11:00:32
簡單回復(fù)
2012-01-08 09:45
回復(fù)
祝福
hls859156樓
2012-01-08 10:03
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zhengjiuhan14樓
2012-01-08 17:28
回復(fù)
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