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yicao917

木蟲(chóng) (小有名氣)

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求支原體培養(yǎng)基的配方即培養(yǎng)條件

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1樓 2012-01-16 00:08:22

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ecolibl21

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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yicao917(金幣+10): ★★★★★最佳答案 2012-01-16 10:15:20
scelab(金幣+5, MicEPI+1): 謝謝熱心回復(fù)哦~ 2012-01-16 13:31:09
amisking(MicEPI-1): 2012-01-16 17:56:10

參照其他相關(guān)資料：
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支原體又稱霉形體，是很小的原核細(xì)胞，完全沒(méi)有細(xì)胞壁．菌體形態(tài)多變，具高度多形性，球形、梨形、分枝的或螺旋的絲狀等。營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，在高血清量的復(fù)雜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在固體培養(yǎng)基上菌落呈油煎荷包蛋樣特征性外觀。

培養(yǎng)基：牛心湯復(fù)合培養(yǎng)基等。分離培養(yǎng)：無(wú)菌采取肺、肝、脾、腎組織，直接剪成小塊放在固體培養(yǎng)基上劃一直線，再用無(wú)菌鉑耳環(huán)在與其垂直方向劃線，或者將組織塊剪碎磨成勻槳，經(jīng)液體培養(yǎng)基連續(xù)系列稀釋后培養(yǎng)．若當(dāng)液體材料為牛乳、排泄物、胎液等，可直接取0.2ML接種于液體培養(yǎng)基或取0.1ML接種于固體培養(yǎng)基。固體瓊脂平板置37攝氏度潮濕需氧條件或在５％二氧化碳下培養(yǎng)48-96h,用斜射光或放大25-40倍的立體顯微鏡檢查,若有特異菌落出現(xiàn),應(yīng)選取散在的單個(gè)菌落用無(wú)菌解剖刀切下小瓊脂塊,用巴氏吸管小心地將菌落和周?chē)傊?再將其移入盛有2-3ML的液體肉湯培養(yǎng)管培養(yǎng)48h,將其培養(yǎng)物通過(guò)0.45微升孔徑大小的濾膜過(guò)濾后作1:10和1:100稀釋,每一個(gè)稀釋液取0.05ML涂布于幾個(gè)瓊脂平板,即可得到純的支原體培養(yǎng)物。

牛心湯復(fù)合培養(yǎng)基：
　　牛心湯1000ml
　　蛋白胨10g
　　氯化鈉5ml
　　酵母提取液10ml
　　無(wú)菌馬血清200ml
　　1.25%醋酸鉈溶液20ml
　　青霉素200IU/ml

實(shí)驗(yàn) 支MP 肺炎支原體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

一、標(biāo)本采集

支原體常侵及人和動(dòng)物的粘膜表面，一般可用棉花拭子涂抹取樣后放入2~3ml支原體液體培養(yǎng)基的小管中，或取其分泌液，若標(biāo)本是組織塊，可在滅菌乳缽或玻璃勻漿后接種，取樣后應(yīng)盡快接種培養(yǎng)。

二、分離培養(yǎng)

1、支原體固體培養(yǎng)基接種法轉(zhuǎn)動(dòng)拭子將標(biāo)本液體盡量擠出，用無(wú)菌滴管吸1~2滴接種在平皿上蓋好，用L棒涂抹或傾斜轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使標(biāo)本均勻分布，置37℃孵育。

2、支原體半固體培養(yǎng)基接種法混種法：在制備半固體培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基加熱溶化，溫度降至50℃時(shí)，添加動(dòng)物血清、酵母浸液及青霉素后混勻，待冷卻至37~40℃時(shí)，用無(wú)菌滴管吸取標(biāo)本0.5~1ml加入培養(yǎng)基中，充分混勻，凝固后置37℃孵育。

3、穿刺接種法：方法同細(xì)菌接種法。

三、結(jié)果觀察
　　絕大多數(shù)支原體為兼性厭氧，少數(shù)在含10% CO2和相對(duì)濕度80~90%的大氣環(huán)境中生長(zhǎng)良好。支原體生長(zhǎng)緩慢，多數(shù)于3~4d長(zhǎng)出菌落，少數(shù)于1~2w方長(zhǎng)出典型菌落，在平皿固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈"油煎蛋"狀，邊緣不整齊。

四、附錄
　　糖酵解培養(yǎng)基（肺炎支原體培養(yǎng)基）
　　基礎(chǔ)培養(yǎng)基 70ml
　　馬（或牛血清） 20ml
　　25%酵母浸液 10ml
　　0.4%酚紅 0.5ml
　　1%醋酸鉈 2.5ml
　　青霉素10000IU/ml 5.0ml
　　調(diào)pH 7.8
　　肺炎支原體培養(yǎng)很簡(jiǎn)單的，特別是液體培養(yǎng)，不需要防護(hù)！
　　配方上面的有點(diǎn)復(fù)雜而模糊，簡(jiǎn)單：
　　PPLO 21g（商品化買(mǎi)）
　　酵母粉 6g（OXIDE）
　　馬血清 200ml（沒(méi)有的話用小牛血清代替）
　　L－半胱氨酸 0.3g
　　葡萄糖 10g
　　1%酚紅 4ml
　　AMP 若干（0.1－0.2g，多加點(diǎn)不影響，但醋酸鉈有毒性的，我不加）
　　這些夠了，我有時(shí)還加SMZ和TMP！
　　ph要調(diào)的，大概在7.5－7.6之間吧！
　　酚紅可以高壓的！
其二

--------------------------------------------------------------------------
1.4 ％PPLO瓊脂培養(yǎng)基
[用途]
分離支原體
[配法]
牛心（去脂絞碎）250g ，氯化鈉5g，胰蛋白酶（不含乳糖）2.5g，蛋白胨10g ，酵母浸膏1g ，瓊脂粉14g ，蒸餾水1L。
（1）牛心消化液配制：取去脂絞碎牛心250g ，氯化鈉5g及蒸餾水900ml混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g / L 氯化鈉溶液中，然后與上述牛心消化液混合，放置50-60 ℃ 水溫箱內(nèi)消化2h ，中間不斷攪拌消化后用兩層紗布過(guò)濾，濾液煮沸5min ，用濾紙過(guò)濾后，補(bǔ)足水分至原量，然后加酵母浸膏1g ，混勻，冷卻后調(diào)pH 至8.0 ，分裝后121 ℃ 滅菌15min 備用。
（2）支原體基礎(chǔ)瓊脂：取上述牛心消化液（已加氯化鈉）1L，加蛋白胨10g 和瓊脂粉14g ，混合后，加熱溶解調(diào)pH 至7.8-8.0，再加熱煮沸，用脫脂棉或絨布過(guò)濾，過(guò)濾后分裝于圓瓶中，每瓶70ml，121 ℃ 滅菌15min 備用
（3） 250g / L 鮮酵母液制備：食用鮮酵母塊250g ，加蒸餾水1L ，混合后，煮沸2min ，用濾紙過(guò)濾，濾后置4 ℃ 冰箱中過(guò)夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g / L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH 至8.0，再煮沸1 次，冷卻后，3000r／min 離心45min ，吸取上清液，分裝于瓶中，121 ℃ 滅菌15min ，放4 ℃ 冰箱中備用，可保存3 月。
（4）傾注平板：溶解基礎(chǔ)瓊脂，冷卻至80 ℃ 左右，每瓶（70ml）內(nèi)立即加預(yù)溫在37℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)的無(wú)菌馬血清或小牛血清20ml , 250g / L 鮮酵母浸出液10ml，10g / L 乙酸鉈溶液2.5ml ，青霉素G 鉀鹽溶液（20 萬(wàn)U / ml )0.5ml 和兩性霉素B 溶液（5mg／ml）0.1ml；充分混勻后傾注9cm平板，經(jīng)37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌試驗(yàn)陰性者，存放4 ℃ 冰箱備用
注：
(1)乙酸鉈是極毒藥品，須特別注意安全操作
(2) 支原體美藍(lán)瓊脂平皿為分離肺炎支原體的選擇性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原體均被抑制生長(zhǎng)，肺炎支原體生長(zhǎng)為“桑椹狀”無(wú)色的菌落
(3) 支原體傳代、移種用0.1 ％半固體瓊脂，配制時(shí)除用0.1 ％瓊脂粉外，其它成分與支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，但不加兩性霉素，此半固體瓊脂分裝在試管內(nèi)滅菌備用。傳代時(shí)將平皿上已選定的支原體菌落用無(wú)菌刀片切下一小塊，直接移種于半固體管中，置適當(dāng)?shù)臍怏w環(huán)境中，培養(yǎng)3-5 天后，可在瓊脂小塊出現(xiàn)“小島狀”絮片生長(zhǎng)物，或呈顆粒狀，即次代支原體
(4) 支原體傳代用液體培養(yǎng)基：其成分與上述支原體半固體瓊脂相同，不加瓊脂粉和兩性霉素B 。
2 肺炎支原體分離用雙相培養(yǎng)基
[用途]
用于喉拭標(biāo)本直接分離肺炎支原體
[配法]
(1)底層瓊脂斜面：其成分與上述支原體半固體瓊脂相同，不加兩性霉素B 。無(wú)菌分裝于經(jīng)滅菌的鏈霉素空瓶中，每瓶3ml，置成斜面，此為底層
(2) 液體培養(yǎng)基：其成分與上述支原體傳代用液體培養(yǎng)基相同。但在未高壓滅菌前，再加入葡萄糖1g ，美藍(lán)0.001g （即10g / L 美藍(lán)溶液0.lml）, 1g / L 酚紅溶液2ml , 115 ℃ 滅菌15min ，冷卻后，再加入輔助成分和防止雜菌生長(zhǎng)的成分。然后，在上述底層瓊脂斜面上，每瓶再加入液體培養(yǎng)基3-5ml，瓶塞用煮沸滅菌的后口橡皮塞經(jīng)37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，無(wú)菌試驗(yàn)陰性者，存放4 ℃ 冰箱中備用，可保存1 月
注：已接種的雙相培養(yǎng)管，培養(yǎng)37℃ 普通環(huán)境2-4 周，觀察結(jié)果，陽(yáng)性生長(zhǎng)見(jiàn)雙相管由淡紫色變成綠色再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，因肺炎支原體發(fā)酵葡萄糖，還原美藍(lán)。取陽(yáng)性管用分離支原體固體平皿分離菌落，平血放入含95 ％氮?dú)夂? ％二氧化碳環(huán)境中，或放入含5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)2-4 周，陽(yáng)性平皿可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)
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另，有很多商品化培養(yǎng)基可以購(gòu)買(mǎi)。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件可能有所不同。

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PCR發(fā)明人穆利斯的成功表明，想象力推動(dòng)進(jìn)步

2樓2012-01-16 09:36:21

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