[交流] 雙酶切問題

雙酶切質(zhì)粒載體，酶切完全后得到兩個片段：約5000bp和100bp，通�；厥誔CR不容易檢測到100bp的條帶，這樣就不容易區(qū)分大片段是雙酶切后產(chǎn)物的還是單酶切產(chǎn)物。當然，采用高濃度凝膠可以檢測出100bp的條帶，不知道還有沒有其他簡單易行的方法進行區(qū)分呢，歡迎指教。

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1樓 2012-02-07 10:54:59

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香菱兒

鐵桿木蟲 (著名寫手)

★
joan198108(金幣+1):謝謝參與

跑PAGE膠
膠回收自連

酶切載體是為了克隆吧，直接往下做，再做一個自連對照看看

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2樓2012-02-07 12:49:58

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brightfuture01

木蟲之王 (文壇精英)

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看天(金幣+2): 鼓勵交流 2012-02-07 13:20:36

常用的一些高效率的限制性內(nèi)切酶如BamHI、EcoRI等酶切幾個小時就完全酶切了，你所提到的這個問題就不存在。如果是低效率的限制性內(nèi)切酶，最好過夜酶切。

最好能切膠回收5000bp的酶切產(chǎn)物，畢竟你的另一段有100bp。

前些年的時候國產(chǎn)試劑盒的質(zhì)量比較差，雖說能回收100以上的DNA片段，但是基本上回收不到100bp�，F(xiàn)在國產(chǎn)試劑盒的質(zhì)量也比較高了，100bp的片段過PCR柱純化試劑盒殘留太多，連接很容易重新連回到載體上�！�

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3樓2012-02-07 13:01:21

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joan198108

鐵桿木蟲 (正式寫手)

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樓: Originally posted by 香菱兒 at 2012-02-07 12:49:58:
跑PAGE膠
膠回收自連

酶切載體是為了克隆吧，直接往下做，再做一個自連對照看看

自連是個不錯的方法，比較直觀，就是操作復(fù)雜了些。謝謝指教！

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4樓2012-02-07 13:21:12

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joan198108

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樓: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 13:01:21:
常用的一些高效率的限制性內(nèi)切酶如BamHI、EcoRI等酶切幾個小時就完全酶切了，你所提到的這個問題就不存在。如果是低效率的限制性內(nèi)切酶，最好過夜酶切。

最好能切膠回收5000bp的酶切產(chǎn)物，畢竟你的另一段有100 ...

現(xiàn)在最關(guān)鍵的問題是5000bp附近片段是已經(jīng)完全雙酶切還是只是單酶切的產(chǎn)物，我想請教一下有沒有簡單的驗證方法。

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5樓2012-02-07 13:44:55

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brightfuture01

木蟲之王 (文壇精英)

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5樓: Originally posted by joan198108 at 2012-02-07 13:44:55:
現(xiàn)在最關(guān)鍵的問題是5000bp附近片段是已經(jīng)完全雙酶切還是只是單酶切的產(chǎn)物，我想請教一下有沒有簡單的驗證方法。

這個還不簡單么，一個PCR搞定。

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7樓2012-02-07 14:17:21

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cxl_yll

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跑一個單酶切的，跑一個雙酶切的，在一個膠上跑，雙酶切的比單酶切的要低一點。我用這個方法檢測過相差200bp的，沒有問題。是不是能多送我金幣啊~~

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joan198108

8樓2012-02-09 09:01:14

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joan198108

鐵桿木蟲 (正式寫手)

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樓: Originally posted by brightfuture01 at 2012-02-07 14:17:21:
這個還不簡單么，一個PCR搞定。

PCR還要設(shè)計合成引物，應(yīng)該是比較麻煩的吧

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9樓2012-02-09 09:33:58

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joan198108

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樓: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 09:01:14:
跑一個單酶切的，跑一個雙酶切的，在一個膠上跑，雙酶切的比單酶切的要低一點。我用這個方法檢測過相差200bp的，沒有問題。是不是能多送我金幣啊~~

我的只是相差100bp，并且另一個片段5000bp+，上面的方法恐怕是不太容易觀察。金幣就不送了，給朵小紅花吧，呵呵

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10樓2012-02-09 09:36:23

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amilie030312

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你這個問題如果是應(yīng)付上圖的那種我給你個建議，不知道行不行，我之前嘗試過用兩塊同樣大小的膠但是濃度不同，在同樣位置來跑，照相的時候兩個膠疊在一起，5000的那個放下面，你可以試試，應(yīng)付上圖可以，如果酶用的好就不用擔心是酶切有問題了，因為肯定沒問題。

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11樓2012-02-09 10:59:20

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cxl_yll

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10樓: Originally posted by joan198108 at 2012-02-09 09:36:23:
我的只是相差100bp，并且另一個片段5000bp+，上面的方法恐怕是不太容易觀察。金幣就不送了，給朵小紅花吧，呵呵

我大片段5000bp多，附件1孔mark,2,3孔質(zhì)粒，4-7雙酶切，8-11是對應(yīng)的雙酶切。我的不太明顯，你可以膠濃度大一些，電壓低一些，跑膠時間長一些。

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附件 1 : 20110330梅切3u.BMP

2012-02-09 15:34:28, 433.05 K

12樓2012-02-09 15:39:21

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cxl_yll

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我相差也是100bp

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13樓2012-02-09 15:40:36

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joan198108

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12樓: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 15:39:21:
我大片段5000bp多，附件1孔mark,2,3孔質(zhì)粒，4-7雙酶切，8-11是對應(yīng)的雙酶切。我的不太明顯，你可以膠濃度大一些，電壓低一些，跑膠時間長一些。

請問你的凝膠濃度多大，濃度太高溶解是個問題，你是如何溶膠的呢？

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14樓2012-02-09 15:56:03

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小木蟲(金幣+0.5):給個紅包，謝謝回帖

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14樓: Originally posted by joan198108 at 2012-02-09 15:56:03:
請問你的凝膠濃度多大，濃度太高溶解是個問題，你是如何溶膠的呢？

膠是3%的，你TAE可以稍微多加一點，它一加熱揮發(fā)厲害，加熱一會，瑤一會，電壓可以設(shè)成90-100伏

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15樓2012-02-09 22:49:48

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joan198108

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樓: Originally posted by cxl_yll at 2012-02-09 22:49:48:
膠是3%的，你TAE可以稍微多加一點，它一加熱揮發(fā)厲害，加熱一會，瑤一會，電壓可以設(shè)成90-100伏

多謝！

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16樓2012-02-10 08:46:41

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clarktao6樓

2012-02-07 13:52 回復(fù)

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