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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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張曉梅ZXM

金蟲 (正式寫手)

meimeizhang

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[求助] 為何PCR產(chǎn)物測序只測一部分？

想做一些看家基因分析，文獻(xiàn)給的擴(kuò)增引物和測序引物信息（位點(diǎn)）結(jié)果如下：
F:1162-1190 R:2126-2155 擴(kuò)增產(chǎn)物994bp
F1:1273-1291 R1:2135-2152 測序產(chǎn)物879bp 實(shí)際測得540bp

問題一：為何測序只測PCR擴(kuò)出來的一部分？如果本來只需這一小段的話為何不直接擴(kuò)這一段？

問題二：根據(jù)測序引物的位點(diǎn)推測產(chǎn)物應(yīng)該是879bp,為何實(shí)際測序結(jié)果是540bp?

很困惑，請教大蝦！感激不盡！

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1樓 2012-02-22 23:06:29

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smilerion

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-23 08:16:07

因?yàn)閿U(kuò)增引物結(jié)合在模板上，測序引物是是結(jié)合在需要測序的PCR產(chǎn)物上的。
同時(shí)測序的結(jié)果在前100bp左右是不準(zhǔn)的，一般不參考。

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2樓2012-02-23 02:56:50

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張曉梅ZXM

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引用回帖:

2樓: Originally posted by smilerion at 2012-02-23 02:56:50:
因?yàn)閿U(kuò)增引物結(jié)合在模板上，測序引物是是結(jié)合在需要測序的PCR產(chǎn)物上的。
同時(shí)測序的結(jié)果在前100bp左右是不準(zhǔn)的，一般不參考。

你的意思我明白，可我的問題還是沒有搞明白
一般PCR產(chǎn)物測序就直接用PCR的引物測，可它這為何是在PCR的目的產(chǎn)物中間選的引物來測序？
測序前100bp確實(shí)不宜參考，可我看它那差的是300多bp��？
為什么呢？

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3樓2012-02-23 09:34:26

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若水5886

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【答案】應(yīng)助回帖

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小丹木木(金幣+2): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-02-24 15:18:57

首先要說明測序引物比擴(kuò)增引物的要求要高，比如Tm值，GC含量，序列結(jié)構(gòu)，要在保守區(qū)等，有時(shí)候設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為了保證擴(kuò)增出來的質(zhì)量，不能和測序引物兼容。
其次，如果測出來的序列只有500多，那么你用擴(kuò)增引物或者測序引物擴(kuò)增出來的片段有多大？目標(biāo)序列少很多肯定不對的

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4樓2012-02-23 10:17:25

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寶杰羅生物

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你擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物有問題，最少也能測到900bp；測序公司沒給你測完，最好重新優(yōu)化條件吧。

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5樓2012-02-23 11:57:45

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引用回帖:

4樓: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-23 10:17:25:
首先要說明測序引物比擴(kuò)增引物的要求要高，比如Tm值，GC含量，序列結(jié)構(gòu)，要在保守區(qū)等，有時(shí)候設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物為了保證擴(kuò)增出來的質(zhì)量，不能和測序引物兼容。
其次，如果測出來的序列只有500多，那么你用擴(kuò)增引物或 ...

第一個(gè)問題明白了，謝謝！
第二個(gè)問題，先聲明一下，我是看的參考文獻(xiàn)，有些問題不明白自己還沒開始做呢。我是根據(jù)它給的測序引物的位點(diǎn)來推測測出的序列應(yīng)該是800多，可它的真正結(jié)果說只有500多，所以我不明白

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6樓2012-02-23 15:45:16

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引用回帖:

6樓: Originally posted by 張曉梅ZXM at 2012-02-23 15:45:16:
第一個(gè)問題明白了，謝謝！
第二個(gè)問題，先聲明一下，我是看的參考文獻(xiàn)，有些問題不明白自己還沒開始做呢。我是根據(jù)它給的測序引物的位點(diǎn)來推測測出的序列應(yīng)該是800多，可它的真正結(jié)果說只有500多，所以我不明白

我不知道文獻(xiàn)具體說的是什么情況，我是不是可以理解為文獻(xiàn)說的目標(biāo)序列其實(shí)是500多呢？測序的時(shí)候前后有部分序列不是目標(biāo)序列的哦，比如說有一部分是載體序列，或者有一部分是測序引物和目標(biāo)序列之間的序列。簡言之，測序引物之間的800多個(gè)堿基只有中間的500多是目標(biāo)序列，其他的不是目標(biāo)序列而已。

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7樓2012-02-23 16:15:34

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這個(gè)就要看你的文章里到底是怎樣處理的，是什么目的了。
如果可以的話，可以把文獻(xiàn)共享一下。這樣會(huì)更有針對性。

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天行健，君子以自強(qiáng)不息；地勢坤，君子以厚德載物。

8樓2012-02-24 14:12:09

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7樓: Originally posted by 若水5886 at 2012-02-23 16:15:34:
我不知道文獻(xiàn)具體說的是什么情況，我是不是可以理解為文獻(xiàn)說的目標(biāo)序列其實(shí)是500多呢？測序的時(shí)候前后有部分序列不是目標(biāo)序列的哦，比如說有一部分是載體序列，或者有一部分是測序引物和目標(biāo)序列之間的序列。簡言 ...

800多是我根據(jù)測序引物推的，500多是它給的結(jié)果，你的說法應(yīng)該是對的，800多當(dāng)中只有500多是目的序列

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9樓2012-02-24 22:18:38

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8樓: Originally posted by 海闊天空8158 at 2012-02-24 14:12:09:
這個(gè)就要看你的文章里到底是怎樣處理的，是什么目的了。
如果可以的話，可以把文獻(xiàn)共享一下。這樣會(huì)更有針對性。

感興趣的話可以看一下，也可能是我看文獻(xiàn)時(shí)候信息沒有領(lǐng)會(huì)全面，歡迎討論和指教！

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附件 1 : 2008_MLSA_for_Streptomycete_Systematics.pdf

2012-02-24 22:21:16, 466.17 K

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10樓2012-02-24 22:22:01

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