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2010203011銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
救命��！熒光定量PCR 擴增問題
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質(zhì)粒擴增和樣品擴增曲線不一樣。 1，湖水總細菌DNA提取，Omega biotek的水體DNA提取試劑盒 2，引物為文獻中的經(jīng)典引物，退火溫度在梯度PCR儀上找的較為適合的溫度。 3，熒光定量PCR儀為ROTOR Gene-6000，試劑盒為QIAGEN。 4，質(zhì)粒是用樣品DNA的PCR產(chǎn)物，回收后重組后提取，按10倍稀釋成標準品。 結(jié)果，每次做的試驗結(jié)果，樣品的擴增曲線總是很奇怪，不光滑。和質(zhì)粒就很不一樣。我已經(jīng)排除了以下幾個原因： 1. 擴增體系，QIAGEN 和Takara的試劑盒都試過，一樣的 問題 2.儀器問題，用過ABI7500比較過，一樣的 問題。 3. 引物，都是文獻中比較常用的引物，noszF/1622-R等。 4.模板，借用了別人用mobio提取的土壤DNA，也有問題，是不是可以排除不是試劑盒的問題？ 5.耗材，ABI和Axygen的用，也沒有解決問題。 求救，博士二年級了，文章還在等數(shù)據(jù)，急死人了，不知道有沒有碰到這樣情況的，請教啊~ |
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yz_fish
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把湖水提取出來的模板DNA稀釋十倍，一百倍或者一千倍后試試，保證樓主能得到心儀的擴增曲線 |
20102030115樓2012-03-14 10:03:03
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銀蟲 (小有名氣)
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| 換一種菌的DNA為模板試一下，有可能是從土壤中提取基因組含有雜質(zhì)影響qPCR的體系吧。排除樣本質(zhì)量的影響 |
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4樓2012-03-14 09:10:49
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| 擴增曲線不好應(yīng)該是樣本的問題，純度和濃度要注意下 |
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6樓2012-03-14 10:52:12
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