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如何測定樣品中活體微生物數(shù)量？
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問題如下：提取土壤等環(huán)境樣品中的總DNA，采用常規(guī)的細(xì)菌或者真菌通用引物或者某種特定基因的引物進(jìn)行定量PCR，那么得出來的是應(yīng)該是該樣品中的總物種數(shù)量。但這個(gè)數(shù)量應(yīng)該也包括一些已經(jīng)死亡的微生物的DNA衍生的值（死亡細(xì)胞有一部分DNA未被降解），應(yīng)該不準(zhǔn)確。 請教高手，有沒有一種方法，將土壤樣品中的死亡細(xì)胞中的DNA去除，然后用熒光定量PCR方法測定活體細(xì)胞的總DNA數(shù)量？謝謝。 |
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你利用的類似宏基因組的方法，提取土壤等環(huán)境樣品中的總DNA，采用常規(guī)的細(xì)菌或者真菌通用引物或者某種特定基因的引物進(jìn)行定量PCR，測定的是大部分微生物的DNA的情況。你沒有必要做所謂的活細(xì)菌啊。因?yàn)椋何⑸锏纳芷诤芏蹋阍谧龅臅r(shí)候肯定有死的有活的菌株，而你做的DNA中所包含的菌株就是反應(yīng)土壤中微生物的情況啊，為什么一定要研究當(dāng)時(shí)活的那一部分呢？ 除非你做的土壤要經(jīng)過特殊處理，那你就知道特殊處理的針對的菌株了。那可以根據(jù)那個(gè)菌株信息進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)啊。 另外，目前可培養(yǎng)的微生物只是很少的一部分，還有你的方法做的也是只一部分，不可能把所有菌株做全的，這樣的話，你所追求的活菌，就沒有什么意義了。 我只是根據(jù)你以上的敘述，給你回復(fù)。但是我不太明白，你為什么要做土壤中，活細(xì)菌的數(shù)量？你的實(shí)驗(yàn)想得到什么方面的結(jié)果呢？你要干什么事情呢？按照你所說，你得到的活菌的情況要干什么呢？ |
2樓2012-03-26 17:17:11
在雨中: 回帖置頂 2012-03-26 20:08:26
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我的意思是，參與土壤活性的微生物，比如細(xì)菌，在特定樣品和特定時(shí)間，它的活性細(xì)菌總數(shù)（活著的）是一定的。我們常規(guī)提取總DNA，然后用通用引物定量PCR，得出的值并不準(zhǔn)確。因?yàn)樘崛〉目侱NA中肯定有一部分是已經(jīng)死亡的細(xì)胞釋放出來的未被降解的DNA，這樣在一定程度上夸大了熒光定量PCR值。您覺得呢？ 我只是想找出一種方法，將土壤樣品中的死亡細(xì)胞中的DNA去除，再用常規(guī)的DNA提取和定量PCR來確定樣品中的細(xì)菌總數(shù)。這樣得出的值，可以算是活細(xì)胞數(shù)量。 |
5樓2012-03-26 20:08:22
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還有，對于活細(xì)菌，有相應(yīng)的方法。 第一，利用相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，但是能培養(yǎng)的細(xì)菌其實(shí)在很少，如果進(jìn)行培養(yǎng)，將有大部分菌株丟失。 第二，利用活細(xì)菌檢測試紙，這個(gè)你管公司問就可以，在微生物實(shí)驗(yàn)里很普遍的。 但是最關(guān)鍵的是，你要搞清楚自己要干什么？要哪些結(jié)果？為什么要這些結(jié)果？根據(jù)哪些結(jié)果可以得到哪些結(jié)論？有些實(shí)驗(yàn)考慮會是多余的。 |
3樓2012-03-26 17:29:44
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我感覺你的這個(gè)考慮是多余的。 你的熒光定量是相對定量，還是絕對定量�。坎还苁窍鄬Χ窟�是絕對定量，都是拿來比較，說是定量，但也是在一定條件下的相對比較。根據(jù)CT值或相對的CT值來進(jìn)行比較，找規(guī)律。實(shí)驗(yàn)中有死菌還是沒有死菌，都是反應(yīng)了菌的相對量。但也不能你跟菌這個(gè)相對量說，某個(gè)菌多多少，只能說相對多多少。并不能根據(jù)已有的CT值或相對的CT值計(jì)算或得到相應(yīng)菌量。 如果你有要定的菌的信息，我建議，你跟菌該菌的信息去做，可能會好些。要是只是根據(jù)總DNA做的總體的PCR，我覺得那就沒必要取出什么死菌了。這里的誤差都會大雨你所謂去除的死菌的數(shù)量。 |
6樓2012-03-26 22:04:29
7樓2012-03-26 22:15:05
4樓2012-03-26 20:02:17
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| 樓主的這個(gè)問題我也很感興趣，開題的時(shí)候就被問到了這個(gè)問題。樓主能不能把這些去除死菌DNA的文獻(xiàn)發(fā)給我？我是郵箱是jianwuxiaoxiang@yeah.net,非常感謝 |
8樓2012-03-29 12:35:57
9樓2012-03-29 14:06:13
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