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引物設(shè)計
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上游1（含信號肽） 5’—3’ TTGATCATGATTACACGTC 上游2（不含信號肽） 5’—3’ 下游 5’—3’ GATCATTGCAGGATCACTAA 引物設(shè)計的怎么樣啊，用oligo，primer5分析里面數(shù)據(jù)太多，看不懂~~ oligo PCR分析（圖1），得到的數(shù)據(jù)，覺得數(shù)據(jù)怪怪的，上下游引物退火溫度差不多就好了，干嘛還有個product Tm呢，總結(jié)論也看不懂 上游引物二聚體分析：圖2 下游引物二聚體分析：圖3 上游錯配分析：圖4 看不懂，糾結(jié)~~還請各位賜教 引物分析時要不要把限制性酶堿基，保護堿基包括在內(nèi)呀~ 圖一（PCR分析） 圖2 上游引物二聚體分析 圖3 下游引物二聚體分析 圖4 上游引物錯配率分析 |
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送鮮花一朵 |
謝謝~~幫助很大 根據(jù)所提的一些要點，我重新設(shè)計了兩條引物 上游1（含有信號肽）AAAAAGAACCTGATCATGATTACACGTC 上游2（不含有信號肽）AGCTTTCCCATCTAGTATTCAA 下游 GATCATTGCAGGATCACTAAAGGAG 上游1：從起始密碼子之前的15個堿基開始設(shè)計的 上游2：不含信號肽的部分不好設(shè)計，鏈短退火溫度低，鏈長會嚴重的形成3'端二聚體， 這一次的引物設(shè)計結(jié)果PCR分析數(shù)據(jù)： [ Last edited by happywyh on 2012-3-27 at 10:37 ] |
5樓2012-03-27 10:35:13
2樓2012-03-26 17:25:23
★ ★ ★
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 只能說，非常感謝對本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 只能說，非常感謝對本版的支持！ 2012-03-27 11:37:58
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嗯.............要不這么來說說吧 1. 首先不明白你上游引物寫了兩個，為什么分析中只有一個，觀察你的序列和引物位置，那么就假設(shè)你P的是某基因的CDS全長 2. 從PCR分析來看，兩引物Tm值相差不大，但較不穩(wěn)定引物與產(chǎn)物Tm值相差達到32.7度，這個比較致命，因為產(chǎn)物與引物Tm相差過高，會引起模板-模板間和模板-引物間的退火競爭效應(yīng)，Oligo軟件設(shè)計官方給出的最大差值是不要超過29度，也有人提出不要超過20度。所以要不增大你引物長度，適當(dāng)增加引物Tm值，要不依舊使用此引物但采用高退火溫度去P。 3. 以假定你是需要擴CDS來講，那么上下游的Dimer實際并不用考慮過多，只要3‘Dimer不是很嚴重就可以了，文中觀察你的Dimer中堿基配對數(shù)量和自由能觀察，你這個引物基本木有問題。 4. 關(guān)于錯配，Primer Premier5中是有錯配是否能生成產(chǎn)物的結(jié)論，如果沒有，怎么錯配了我們都不管，或是錯配產(chǎn)物遠遠小于P產(chǎn)物，那么我們也是不管，而Oligo好像是看上頭Primering efficiency的，上游引物第一個與正義鏈的錯配分數(shù)較高，但感覺也不會出現(xiàn)問題。 5. 再說明一下，需要另加的酶切位點和保護堿基是不算在引物分析之內(nèi)的。 6. 以你就是要P某基因的CDS為例，反正正反開始都限定了，你就選個合適的引物長度去P就是了，注意長度要盡量長一點，保證高退火下的特異性就可以了。 純屬個人經(jīng)驗，不足之處或說錯之處希望高手出現(xiàn)并指正，祝實驗成功  |
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3樓2012-03-26 22:33:37
6樓2012-03-27 12:50:15
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