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楊文心木蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
肝素前體heparosan亞硝酸裂解法制二糖GlcA-AnMan
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各位朋友，小蟲(chóng)最近在做一個(gè)二糖的合成，葡萄糖醛酸-2,5-脫水甘露醇（GlcA-AnMan，其分子量約340），原料是發(fā)酵制得的肝素前體（heparosan）,用化學(xué)方法反應(yīng)制備（亞硝酸裂解法），現(xiàn)在對(duì)于此二糖的分離純化和檢測(cè)方面有諸多不懂，望對(duì)糖類(lèi)有研究的蟲(chóng)友們可以多多指教。 我要合成的二糖買(mǎi)不到標(biāo)準(zhǔn)品，文獻(xiàn)上對(duì)此二糖也沒(méi)有多少說(shuō)明。對(duì)于其在醇溶液中的溶解度不是很清楚，是否有紫外吸收也不曉得。（不過(guò)猜想可能有，因?yàn)橛刑侨┧峤Y(jié)構(gòu)） 實(shí)驗(yàn)方案是合成反應(yīng)完后將反應(yīng)液先過(guò)DEAE柱粗分純化，紫外280nm檢測(cè)，將屬于同一峰型的洗脫液合并，再將合并后的洗脫液濃縮后過(guò)Sephadex G25脫鹽分離，也是紫外280nm檢測(cè)收集，最后也是將屬于同一峰型的洗脫液合并蒸發(fā)濃縮后凍干。 已經(jīng)做完一次預(yù)實(shí)驗(yàn)了，中間出現(xiàn)許多問(wèn)題，現(xiàn)列出來(lái)求賜教。 一、分離純化 1.過(guò)DEAE柱之前是否需要加一步驟先除鹽呢，看資料說(shuō)DEAE填料是低鹽吸附，高鹽洗脫，想問(wèn)下能否不除鹽呢，直接把反應(yīng)液稀釋n多倍，使其鹽濃度非常小，這樣經(jīng)過(guò)DEAE柱時(shí)反應(yīng)液中的鹽應(yīng)該不會(huì)被柱子吸附了吧。 2.如果必須除鹽的話(huà)，自己想出的方法有1、乙醇分級(jí)沉淀法，加入乙醇使反應(yīng)液成不同的純濃度而使糖析出，但是不清楚我的目標(biāo)二糖在醇溶液中的溶解度怎樣，覺(jué)得會(huì)比較繁瑣。2、蒸發(fā)結(jié)晶，隨著水分的減少鹽應(yīng)該會(huì)優(yōu)先析出，然后離心取上清液再過(guò)DEAE柱，此法蒸發(fā)量不確定，擔(dān)心把糖也一并析出來(lái)。請(qǐng)問(wèn)各位有什么較好的方法么？ 3.因?yàn)槲业哪繕?biāo)二糖分子量只有340，除鹽的話(huà)相差還不到一個(gè)數(shù)量級(jí)，而裂解過(guò)程中也可能產(chǎn)生四糖、六糖、八糖、十糖等其他低分子寡糖，我使用Sephadex G25試過(guò)一次，分離效果并不好，請(qǐng)問(wèn)此操作有沒(méi)有什么需要注意的地方，如使用更長(zhǎng)點(diǎn)的柱子（自己用的柱子是1.6*50cm），上樣量再少點(diǎn)(試過(guò)1ml，但效果不好)，分離效果會(huì)不會(huì)要好些呢？還有其他比較好的方法么？ 二、檢測(cè) 我是紫外280nm檢測(cè)的，我的原料紫外掃描過(guò)知道在此波長(zhǎng)處是有吸收的，但是我的二糖因?yàn)闆](méi)有標(biāo)準(zhǔn)品，其實(shí)在此波長(zhǎng)有沒(méi)有吸收心里是沒(méi)底的，只是從結(jié)構(gòu)分析二糖和原料相似，猜想可能有的。還有一個(gè)問(wèn)題是我的反應(yīng)試劑用到了NaNO2，此試劑在280nm處也是有吸收的，因而這個(gè)檢測(cè)方法始終覺(jué)得有點(diǎn)懸。想過(guò)改進(jìn)檢測(cè)方法1、用苯酚硫酸法測(cè)每管洗脫液的吸光度，以此代替可疑的280nm處吸光度2、使用液相糖柱-示差檢測(cè)每管洗脫液以確定同一物質(zhì)的洗脫液然后合并。這種方法又涉及糖柱的選擇了，對(duì)此一竅不通，而且做液相沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品感覺(jué)很麻煩的，還望有懂的可以不吝賜教。 heparosan GlcA-AnMan |
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楊文心
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3樓2018-06-07 14:39:30
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