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[求助] 問問pet-28a克隆構(gòu)建引物的問題

如果設(shè)計(jì)帶C端his的引物，是不是下游只能用NCoI這個(gè)酶切位點(diǎn)啊，XbaI和NcoI之間的RBS對C端his表達(dá)有影響么，需要保留它么？
附pet-28a圖譜

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1樓 2012-04-17 09:21:32

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太極拳

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rbs序列不要去除，可以設(shè)計(jì)引物時(shí)加上其他的酶切位點(diǎn)緊連上his序列即可，注意加上保護(hù)堿基，另外要注意堿基數(shù)量，別導(dǎo)致發(fā)生移碼，以至于沒法表達(dá)His

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2樓2012-04-17 10:28:26

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引用回帖:

2樓: Originally posted by 太極拳 at 2012-04-17 10:28:26:
rbs序列不要去除，可以設(shè)計(jì)引物時(shí)加上其他的酶切位點(diǎn)緊連上his序列即可，注意加上保護(hù)堿基，另外要注意堿基數(shù)量，別導(dǎo)致發(fā)生移碼，以至于沒法表達(dá)His

如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是從C端開始表達(dá)的么，rbs都在終止密碼子后面，有意義么？

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3樓2012-04-17 10:52:58

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susizheng

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引用回帖:

3樓: Originally posted by castlered at 2012-04-17 10:52:58:
如果是N端his肯定要保留rbs，C端也要么？C端不是從C端開始表達(dá)的么，rbs都在終止密碼子后面，有意義么？

不對，RBS（核糖體附著位點(diǎn)）是緊跟啟動(dòng)子和操縱子的，在起始密碼子ATG之前，怎么會跑到終止密碼子后面呢？看質(zhì)粒圖譜方向反了吧。

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4樓2012-04-17 11:15:06

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RBS ribosome binding sequence，是翻譯時(shí)核糖體結(jié)合位點(diǎn)，需要保留，還有注意去掉要表達(dá)蛋白的終止子，建議用NcoI和XhoI注意后面的酶切位點(diǎn)選擇，選擇不好有可能出現(xiàn)移碼。

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5樓2012-04-17 11:18:11

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4樓: Originally posted by susizheng at 2012-04-17 11:15:06:
不對，RBS（核糖體附著位點(diǎn)）是緊跟啟動(dòng)子和操縱子的，在起始密碼子ATG之前，怎么會跑到終止密碼子后面呢？看質(zhì)粒圖譜方向反了吧。

pet-28a質(zhì)粒不是可以構(gòu)建N端his和C端his么？N端當(dāng)然是正常的了，rbs在2啟動(dòng)子之后，ATG之前。但是用C端his呢？

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6樓2012-04-17 11:18:32

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引用回帖:

6樓: Originally posted by castlered at 2012-04-17 11:18:32:
pet-28a質(zhì)粒不是可以構(gòu)建N端his和C端his么？N端當(dāng)然是正常的了，rbs在2啟動(dòng)子之后，ATG之前。但是用C端his呢？

C端his,肯定是在基因之后，C端的his想要表達(dá)，需要突變掉你基因的終止密碼子，并且要保證后面堿基數(shù)目。

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7樓2012-04-17 11:26:13

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看了這么多回復(fù)，感覺都沒說全啊。pET28a上面兩個(gè)His tag，第一個(gè)當(dāng)然是表達(dá)N端帶his用的，第二個(gè)是用來表達(dá)C端帶his用的。你想表達(dá)C端帶his的，怎么能扯到rbs序列那里。要是N端不想要多余的東西，直接用上游NcoI加下游XhoI好了，別忘了給你要表達(dá)的片段加上ATG起始密碼子，要是全長，就不用在N端加ATG，但是末尾要去掉終止密碼子。

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8樓2012-04-17 14:10:35

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nemo88

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9樓2012-04-17 15:18:37

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其實(shí)我也是初學(xué)者，說點(diǎn)自己看法。希望能幫上忙啊。
pET28a的MCS中不是有兩個(gè)His tag，你要是C端的his和前面的rbs有什么關(guān)系？反正是ATG起始表達(dá)加上酶切位點(diǎn)加上tag再TGA結(jié)束不久可以了。
引物設(shè)計(jì)上游就從atg往rbs方向反向互補(bǔ)選21個(gè)左右堿基，加上你的蛋白中選21個(gè)左右的同源序列。下游同理。
順便說一下，我用pET28a做共轉(zhuǎn)化，一直是P出來的載體很差，假陽性占據(jù)大多。

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10樓2012-04-17 16:05:28

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