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[交流]
克隆基因全長引物設計問題 已有9人參與
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已知一序列全長，如何根據(jù)此序列設計引物克隆出全長，我是新手，麻煩各位詳細介紹一下設計全長引物的步驟，最近實驗急需，非常感謝！��！ 我以前克隆過片段，沒有做過全長，引物設計的一些基本原則都已了解，但是設計全長引物一點都不懂，勞煩各位，謝謝！ |
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sd3824289
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引物設計應注意如下要點： 1 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。 2 引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加[2]。 3 引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5 引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)。 6 ∆G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端∆G 值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間∆G 值相對較高的引物。引物的3’端的∆G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發(fā)DNA 聚合反應[6]。 7 引物二聚體及發(fā)夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。 8 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。 另外本人建議樓主在論壇里搜索一下primer 5.0軟件！很好用的！ |
27樓2012-07-25 16:36:12
zhuifeng7000
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7樓2009-11-06 00:09:19
xiangao
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8樓2009-11-06 07:32:55
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