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feitianrenwo木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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[交流]
【求助/交流】求助基因克隆方面的問(wèn)題解決方案 已有10人參與
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求助基因克隆方面的問(wèn)題解決方案 本人正在克隆一個(gè)微生物的一個(gè)基因，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增基因組DNA，獲得了幾個(gè)DNA片段，在NCBI里比對(duì)，與一些微生物的同源性達(dá)到80%以上，我想知道有了這些DNA片段的序列，如何知道相應(yīng)的氨基酸序列呢？然后如何得到該基因的全長(zhǎng)？（已經(jīng)知道沒(méi)有內(nèi)含子） |
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| 有了DNA序列如何知道相應(yīng)的aa氨基酸序列？翻譯啊，無(wú)論是什么序列，只要是功能基因，那么只有一個(gè)閱讀框是正確的，你可以正向反向翻譯，去掉一個(gè)堿基再翻譯，去掉兩個(gè)堿基再翻譯，在翻譯中不中斷的序列即是正確的閱讀框，拿翻譯的結(jié)果去做蛋白質(zhì)blast |
2樓2010-05-14 19:57:24
yujiaping1
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首先樓主要說(shuō)明白，獲得的片段是從頭到尾的，還是只是一部分，就是說(shuō)樓主要說(shuō)明白引物是怎么設(shè)計(jì)的，在什么位置設(shè)計(jì)的，明確這一點(diǎn)的目的是要知道是否包含完整的閱讀框。 如果樓主PCR所用引物比較靠近兩端，就是說(shuō)基本能包含完整的閱讀框，那么直接使用NCBI的ORF fineder就可以了，可以直接找到整個(gè)開(kāi)放閱讀框，并且翻譯出氨基酸序列，包含起始密碼子和終止密碼子 |
3樓2010-05-14 20:39:21
feitianrenwo
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4樓2010-05-15 09:52:57
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feitianrenwo(金幣+1): 2010-05-16 09:44:11
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feitianrenwo(金幣+1): 2010-05-16 09:44:11
| 恩，8k是有點(diǎn)難弄的，需要摸摸條件，不是一次性就能很順利出來(lái)的。當(dāng)然根據(jù)同源保守序列設(shè)計(jì)的引物跑出來(lái)的產(chǎn)物也不一定對(duì)的，需要不斷的測(cè)序，上ncbi比對(duì)，如果比對(duì)結(jié)果和預(yù)期相符再考慮race或walking，沒(méi)有全基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拿全長(zhǎng)是需要花費(fèi)不少時(shí)間的，特別是你這么長(zhǎng)的序列。當(dāng)然你說(shuō)的翻譯啥的不用考慮太多吧，直接上blastx，tblastx等就會(huì)自動(dòng)幫你翻譯去比對(duì)蛋白了，這個(gè)不是問(wèn)題，關(guān)鍵是先要保證p出來(lái)的片段測(cè)序后是自己需要的目的基因上的，才能往下繼續(xù)調(diào)整后獲取全長(zhǎng) |
10樓2010-05-15 21:23:42
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