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vs570588木蟲 (正式寫手)
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[求助]
怎樣建立基因文庫(kù)，以及用它建立生物發(fā)育樹
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| 我的問題，用污泥馴化富集可以降解某種特定污染物的混合菌，現(xiàn)在要分析微生物菌落結(jié)構(gòu)。想通過建立基因文庫(kù)。來建立系統(tǒng)發(fā)育樹。原來的方法是做DGGE,再進(jìn)行克隆，測(cè)序。發(fā)現(xiàn)大量外文文獻(xiàn)里，很少做DGGE,普遍方法是，做完P(guān)CR后，就純化，克隆，測(cè)序，不過測(cè)序量十分大。我是個(gè)初學(xué)者，希望大家能提供詳細(xì)的過程。另外大家能評(píng)價(jià)下，DGGE后的克隆測(cè)序做系統(tǒng)發(fā)育樹和直接PCR后克隆測(cè)序用啥區(qū)別？當(dāng)然引物用一樣的。 |
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vs570588
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2樓2011-06-11 13:39:55
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【答案】應(yīng)助回帖
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vs570588(金幣+1): 謝謝 2011-06-12 09:49:31
西瓜(金幣+4): 鼓勵(lì)應(yīng)助。高人噢！ 2011-06-12 17:48:15
vs570588(金幣+1): 謝謝 2011-06-12 09:49:31
西瓜(金幣+4): 鼓勵(lì)應(yīng)助。高人噢！ 2011-06-12 17:48:15
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我是專做dgge的 感覺先做這個(gè)可以有一個(gè)大概的，顯著的，有針對(duì)性的了解一個(gè)微生物生態(tài)系統(tǒng)中有哪些菌，哪些多些。有一個(gè)明顯的比較。 直接PCR就大海撒網(wǎng)了 克隆出啥就是啥 只能知道有他這玩意兒，是多是少就不曉得了，有些時(shí)候克隆出的可能是數(shù)量很微小的不具代表性的細(xì)菌種群。。。。。。。。。。。。。。 |
3樓2011-06-11 18:19:55
vs570588
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4樓2011-06-12 09:53:40
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【答案】應(yīng)助回帖
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西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！一并獎(jiǎng)勵(lì)了。 2011-06-12 17:49:05
vs570588(金幣+1): 有道理 2011-06-13 10:02:50
西瓜(金幣+5, EPI+1): Good！一并獎(jiǎng)勵(lì)了。 2011-06-12 17:49:05
vs570588(金幣+1): 有道理 2011-06-13 10:02:50
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一般是100多到500這樣子的，再大就不能良好的分析了 ，這是DGGE的一個(gè)缺陷，你原來的是190多的片段吧 ，好像是V3 的吧，太短了點(diǎn)，現(xiàn)在一般要求做長(zhǎng)點(diǎn)了 V3-V6左右吧 ，還有本來你的樣品中就是許多不可培養(yǎng)細(xì)菌，沒有比對(duì)上的也可能正常，不過V3 的確也太短了。 |
5樓2011-06-12 12:53:34
gayalynau
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【答案】應(yīng)助回帖
vs570588(金幣+2): 好的謝謝 2011-06-13 10:03:39
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如果做文庫(kù)，強(qiáng)烈建議用F27和R1492引物直接擴(kuò)展克隆后測(cè)序，一般來說要送樣100個(gè)，當(dāng)然用SHANNON指數(shù)等軟件可以計(jì)算出最低送樣量，考慮到現(xiàn)在測(cè)序費(fèi)用降低，從我們發(fā)表了16S全長(zhǎng)的文庫(kù)來看，送樣120-150個(gè)就OK，根據(jù)OTU在做樹，具體方法的優(yōu)缺點(diǎn)可以參考我的一篇綜述： Mol Biol Rep. 2008 Jun;35(2):265-74. Epub 2007 May 5. The use of molecular techniques based on ribosomal RNA and DNA for rumen microbial ecosystem studies: a review. （它引10次） 盡管是做瘤胃微生物，套路一樣，只是樣品來源不同而已。 DGGE適合于在做完文庫(kù)后篩選優(yōu)勢(shì)菌，可以用這個(gè)方法， |
6樓2011-06-12 19:25:17
vs570588
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8樓2011-06-13 10:21:46
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9樓2011-06-14 13:12:44
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10樓2011-06-15 19:13:26
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