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[交流] 基因組文庫構(gòu)建時DNA酶切片段用膠回收嗎？

RT，我構(gòu)建的是細菌的基因組文庫，基因組DNA BamHI酶切后顯示大多在3K-7K,少數(shù)<3K,請問
1）我還用選擇性的膠回收某個范圍大小的片段嗎，因為我也不知道我要的基因在多大片段上？
2）如果不回收的話怎么處理酶切后產(chǎn)物進行連接反應(yīng)（用pUC19載體），我看有65度5min滅活限制酶的，可行嗎？
謝謝，請大俠指點

[ Last edited by youngsun50 on 2012-1-2 at 10:18 ]

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西瓜(金幣+1): 老專家，常來啊~ 2012-01-03 08:33:49

文庫構(gòu)建時盡量用較大的片段，切膠回收沒商量。

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2樓2012-01-02 18:54:44

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quiller2000

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你要先調(diào)查一下你的基因組中一般情況下基因的大��；一般都要用膠回收！

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3樓2012-01-02 20:10:23

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樓: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 18:54:44:
文庫構(gòu)建時盡量用較大的片段，切膠回收沒商量。

但我怕漏掉小片段啊，能用PCR回收試劑盒把所有的片段都回收做連接嗎，小片段對連接沒影響吧？
另，pUC載體最大能插入多大的片段啊？謝謝

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4樓2012-01-02 20:57:01

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4樓: Originally posted by youngsun50 at 2012-01-02 20:57:01:
但我怕漏掉小片段啊，能用PCR回收試劑盒把所有的片段都回收做連接嗎，小片段對連接沒影響吧？
另，pUC載體最大能插入多大的片段��？謝謝

<10kb, 你需要補充下文庫質(zhì)量評價方面的知識。

有一個概念你需要自己查一下：覆蓋度

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5樓2012-01-02 23:17:07

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可以直接連接試試效果不好的話用PCR產(chǎn)物純化試劑盒直接純化就可以了（qiagen有一個 50次 1000 挺不錯）回收大于100bp的片段

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6樓2012-01-04 00:18:12

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樓: Originally posted by brightfuture01 at 2012-01-02 23:17:07:

<10kb, 你需要補充下文庫質(zhì)量評價方面的知識。

有一個概念你需要自己查一下：覆蓋度

謝謝！再請教幾個問題：
1)酶切時是不完全酶切嗎，我用的六堿基酶切過夜，結(jié)果小于2K的也有，并不集中在3k-8k間，我這樣是不是不行啊?
2)一般構(gòu)建文庫需要DNA片段多少啊，0.1pmol夠嗎
3)轉(zhuǎn)化一般要涂多少個板子啊才能篩到自己想要的
我第一次做，實驗室也沒做過的，問題有點多希望不要煩，最好能說一下各個步驟的注意心得啥的，謝謝高手了��！

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7樓2012-01-11 17:16:52

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小丹木木(金幣+1): 回答的很藝術(shù)，也很簡單明了哦 2012-01-12 08:34:18
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引用回帖:

7樓: Originally posted by youngsun50 at 2012-01-11 17:16:52:
謝謝！再請教幾個問題：
1)酶切時是不完全酶切嗎，我用的六堿基酶切過夜，結(jié)果小于2K的也有，并不集中在3k-8k間，我這樣是不是不行啊?
2)一般構(gòu)建文庫需要DNA片段多少啊，0.1pmol夠嗎
3)轉(zhuǎn)化一般要涂多少個板 ...

1)酶切時是不完全酶切嗎，我用的六堿基酶切過夜，結(jié)果小于2K的也有，并不集中在3k-8k間，我這樣是不是不行啊?
不完全酶切。

2)一般構(gòu)建文庫需要DNA片段多少啊，0.1pmol夠嗎
不夠。

3)轉(zhuǎn)化一般要涂多少個板子啊才能篩到自己想要的
運氣有的時候很重要。

我第一次做，實驗室也沒做過的，問題有點多希望不要煩，最好能說一下各個步驟的注意心得啥的，謝謝高手了��！

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8樓2012-01-11 17:25:15

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