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lulushuo鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
切膠回收過(guò)程有可能對(duì)DNA造成損傷嗎？
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Sample Text 最近的實(shí)驗(yàn)遇到了一個(gè)很怪的問(wèn)題，我對(duì)載體pAcGFP1進(jìn)行線(xiàn)性化PCR，然后切膠回收，用的是QIAGEN膠回收試劑盒，200ul的PCR體系，40ul EB洗脫后，濃度在110ng/ul左右，電泳驗(yàn)證也沒(méi)有問(wèn)題。但是當(dāng)我對(duì)其高溫加熱時(shí)，也就是只加buffer和水，放入PCR儀，運(yùn)行PCR程序，5個(gè)循環(huán)，約30min，再跑電泳，回收產(chǎn)物就變成彌散狀態(tài)，沒(méi)有主帶；我用乙醇沉淀回收的PCR產(chǎn)物，做同樣實(shí)驗(yàn)，DNA就會(huì)穩(wěn)定存在。請(qǐng)問(wèn)各位分子高手，是切膠回收過(guò)程對(duì)DNA造成損傷了嗎？導(dǎo)致其在高溫下不穩(wěn)定？有沒(méi)有遇到同樣情況的同學(xué)��？幫忙分析一下啊~~跪求��！ 1.png |
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凌波麗
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【答案】應(yīng)助回帖
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myprayer: 金幣+1, 贈(zèng)人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊�？鞓�(lè)每一天 2013-05-06 14:45:17
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你的PCR結(jié)果電泳彌散，可能是非特異性擴(kuò)增多，即出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶。也就是：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)低、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過(guò)多有關(guān)（過(guò)多一般是超過(guò)25次循環(huán)，你只循環(huán)5次應(yīng)該沒(méi)有問(wèn)題）。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。 其對(duì)策有：首先可以提高鎂離子的濃度， 由1.0mmol/L起以0.05mmol/L為單位逐漸上升，最高不超過(guò)10.0mmol/L。提高鎂離子的濃度無(wú)效的話(huà)，調(diào)整引物濃度（你的PCR結(jié)果電泳拖尾，可能是非特異性擴(kuò)增多，因此應(yīng)適當(dāng)降低引物濃度），適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。適當(dāng)提高退火溫度。以上都不行則要重新設(shè)計(jì)引物。每種調(diào)整均可以分梯度進(jìn)行。 切膠回收一般如果剪切力不大的話(huà)，一般不會(huì)引起DNA斷裂。 另外可能是PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)生了污染。污染原因： (一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。 (二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。 |
2樓2013-05-06 12:22:11
gyesang
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3樓2013-05-06 12:27:31
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4樓2013-05-06 12:34:18
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5樓2013-05-06 12:41:09
lulushuo
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謝謝1樓如此細(xì)致的分析！但確實(shí)是理解錯(cuò)了，我只是運(yùn)行PCR程序，不做PCR，因?yàn)槲抑坝眠@個(gè)膠回收的線(xiàn)性化載體做PCR時(shí)持續(xù)失敗，所以就開(kāi)始找原因，做個(gè)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)是其在PCR條件下自身不穩(wěn)定，所以就開(kāi)始懷疑是切膠回收的過(guò)程出現(xiàn)了問(wèn)題。只是想知道切膠回收的過(guò)程是否會(huì)對(duì)DNA造成損傷，有哪些環(huán)節(jié)可能造成這個(gè)損傷。。。 |
6樓2013-05-06 12:47:32
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7樓2013-05-06 12:59:40
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8樓2013-05-06 13:04:01
竹子小小
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9樓2013-05-06 18:49:44
stevenshi021
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lulushuo(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-07 00:54:44
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
lulushuo(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖應(yīng)助！ 2013-05-07 00:54:44
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這個(gè)我離心我感覺(jué)不要緊的，我個(gè)人認(rèn)為在高溫處理情況下DNA會(huì)變性，所以當(dāng)你直接跑膠時(shí)候DNA還my完全復(fù)性所以會(huì)產(chǎn)生好多非完全復(fù)性的中間體，照成你的這種彌散結(jié)果尤其是對(duì)那種高GC含量的DNA這種現(xiàn)象尤其嚴(yán)重。至于你說(shuō)使用ethanol沉淀后的沒(méi)有此現(xiàn)象我就不清楚了。 希望有幫助 |
10樓2013-05-06 23:50:56
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