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簡(jiǎn)單HE認(rèn)真木蟲(chóng) (小有名氣)
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蛋白切膠回收如何操作？
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| 我有一個(gè)蛋白，是GST融合標(biāo)簽的，但始終在包涵體表達(dá)，不知該怎麼純化，想請(qǐng)教一下各位大俠？另外，問(wèn)一下切膠回收行不？該怎麼作呢? |
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linxt2005
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-18 18:54:39
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-18 18:54:39
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看你的用途是什么。 切膠回收的樣品活性很難保證，若是用于抗體制備的話，可以考慮。 具體方法為： 1. 電泳，根據(jù)需要選擇可以上樣孔的容量。 2. 電泳后，用 1M KCl 溶液染色，條帶須仔細(xì)分辨，淡白色。 3. 切隔出目的條帶，存放于適當(dāng)容器中 4. 加入適合溶液（有時(shí)PBS，效果不錯(cuò)），搗碎膠條，4度放置過(guò)夜，提取蛋白。 5. 次日取樣檢測(cè)。 |
2樓2012-10-18 17:14:22
linxt2005
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-26 08:04:39
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-26 08:04:39
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從表達(dá)的角度分析，融合了GST標(biāo)簽的目的之一，就是促進(jìn)可溶表達(dá)。 但若一直是以包涵體形式表達(dá)，則用途不大，而且走變、復(fù)性的路線也會(huì)由于受到GST標(biāo)簽的影響而變 得不大合適。 若是這種情況建議可以考慮進(jìn)行表達(dá)優(yōu)化，方法如下： 1. 表達(dá)條件優(yōu)化，培養(yǎng)基、溫度、誘導(dǎo)條件、抗生素用量等，可能是由于表達(dá)速度太快導(dǎo)致了不溶，可以通過(guò)溫度、誘導(dǎo)劑用量等來(lái)調(diào)節(jié)； 2. 宿主菌，嘗試一些其他的宿主菌，可能由于表達(dá)的目的蛋白對(duì)宿主有毒性等原因?qū)е铝瞬蝗堋?br /> 3. 載體，涉及到構(gòu)建問(wèn)題，更換至SUMO、MBP等融合標(biāo)簽，測(cè)試表達(dá)效果，另外若是目的蛋白一直以包涵體形式表達(dá)，可以考慮只融合His標(biāo)簽或者不帶標(biāo)簽而走變、復(fù)性路線； 若更換表達(dá)系統(tǒng)，涉及到整個(gè)構(gòu)建、表達(dá)體系，建議后續(xù)考慮。 |
5樓2012-10-19 09:28:56
3樓2012-10-18 19:32:54
xhjggl
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4樓2012-10-18 20:46:53
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6樓2012-10-24 20:16:56
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7樓2012-10-24 20:18:56
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8樓2012-10-25 23:25:36
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9樓2012-10-28 18:51:41
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10樓2014-07-02 18:12:43
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