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329939815木蟲 (正式寫手)
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[求助]
求助：關(guān)于考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)
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本人最近測牛血清蛋白（1mg/ml），100微升（加入3ml考馬斯亮藍(lán)）的吸光度只有0.332。 相關(guān)系數(shù)0.9866，奔潰！ 第一次做這個東西，迷茫了，不知道出了什么問題！ 有沒有在武漢的學(xué)校用這種方法測蛋白的蟲友呀？求認(rèn)識...求教！急，謝謝�。。。。� 本人在武漢...繼續(xù)請教，謝謝！ |
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考馬斯染液不是G-250嗎？R-250我們是用來進(jìn)行電泳染色的呀 而且是需要過濾的 考馬斯不容易溶解并且容易有雜質(zhì)在里面， 另外你的標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入后混勻了嗎？測吸光值的時候比色皿洗干凈了嗎？ 我們在做標(biāo)曲的時候用96孔板酶標(biāo)儀比色做出來的標(biāo)曲相關(guān)系數(shù)能達(dá)到三個九 你要有條件用酶標(biāo)儀比色會更好的~  |
12樓2012-04-20 10:45:47
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R250一般用于SDS-PAGE膠的染色，G250一般用于初步檢測是否有蛋白 R250(Coomassie brilliant blue R250).C45H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560―590nm.染色靈敏度比氨基黑高5倍.尤其適用于SDS電泳微量蛋白質(zhì)染色.但蛋白質(zhì)濃度超出一定范圍時,對高濃度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析時要注意這點(diǎn). G250, 又名Xylene brilliant cyaninG.比考馬斯亮藍(lán)R250多二個甲基.MW=854;λmax=590―610nm.染色靈敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體,能選擇地染色蛋白而幾乎無本底色.所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色,適于作定量分析. G250中的G就是Green，偏綠，R250中的R代表Red，偏紅，在進(jìn)行小分子量蛋白的Tricine電泳是常用G250染色，至于加熱，染和脫色都可以加熱，但都是在急需知道結(jié)果的情況下采用，加熱后染的背景色很重脫色時間就長而且很難將背景色脫干凈，脫色液經(jīng)常加熱會導(dǎo)致固定劑的會發(fā)，很快脫色劑就沒用了，脫色效果很差，而且加熱揮發(fā)出來的甲醛對呼吸道有刺激作用因此盡量不要加熱！ G250配完是棕紅的，遇蛋白才會變藍(lán) |
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32993981513樓2012-04-20 11:15:30
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1. 考馬斯亮藍(lán)工作液需要過濾，配制時選用超純水配制。配制后不可放置時間過長。 2. 牛血清蛋白精確定量，可以將其測定體積擴(kuò)大至0.5ml+0.5ml超純水+2ml考馬斯亮藍(lán)工作液。 3. 確定測定儀器及條件無誤。595nm處測定，儀器參數(shù)常規(guī)設(shè)置。 4. 實(shí)驗(yàn)至少3次重復(fù)，求其平均值進(jìn)行計算分析。 祝好！ |
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