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emma立夏鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
雙酶切連TA后切不開(kāi)
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各位大俠，這里看~~~ 一、我的目的片段已經(jīng)與pMD-18Tsimple vector連接上之后，挑菌落pcr有目的條帶呈陽(yáng)性。 二、然后提質(zhì)粒之后做雙酶切�？墒菂s切不開(kāi)。用的是EcoR l 和Sal l兩種酶，我做的是20ul體系，反應(yīng)3h，37°c，水浴。 三、電泳結(jié)果，與未酶切的質(zhì)粒條帶做對(duì)比，條帶跑到后面，EcoR l 單酶切了，但是Sal l與沒(méi)有酶切組相同。 我考慮的問(wèn)題： 因?yàn)槲业膒cr引物自加上了這兩種酶切位點(diǎn)，但是當(dāng)時(shí)沒(méi)有考慮到保護(hù)堿基的特異性，都只是在酶切位點(diǎn)后加了一個(gè)A。是不是這個(gè)引物設(shè)計(jì)的時(shí)候出現(xiàn)問(wèn)題了？ PS：酶活應(yīng)該是沒(méi)有問(wèn)題的，因?yàn)橛脕?lái)切過(guò)實(shí)驗(yàn)室的其他載體，能切開(kāi)的。 現(xiàn)在想要擴(kuò)增這個(gè)片段，然后插入表達(dá)載體，但是一直切不開(kāi)，很痛苦，做了一個(gè)多月了。大家請(qǐng)幫幫忙，八仙過(guò)海各顯神通~~~本人不勝感激~！ |
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4樓2012-05-01 15:22:26
★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
看天: 金幣+3, 鼓勵(lì)回答 2012-05-01 12:10:40
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2樓2012-05-01 11:43:53
emma立夏
鐵蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2012-05-01 14:01:12
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emma立夏5樓2012-05-02 08:23:32
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