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liuxueyan21金蟲 (小有名氣)
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[求助]
考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白過程中的問題
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各位師兄師姐，緊急求助，就是用考馬斯亮藍(lán)法測定土壤蛋白，但是不管是預(yù)實(shí)驗(yàn)還是正式試驗(yàn)，測定的結(jié)果并不相同，盡管重復(fù)了很多次，不知道問題出哪里了？忘各位師兄師姐幫幫忙。 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，BSA是需要每次測定都要重新配制嗎？在測樣品的時(shí)候是直接加100ul待測樣品，其他與標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣。 2、提取的土壤蛋白儲(chǔ)存在4°冰箱中，放置一個(gè)禮拜左右，對(duì)測定結(jié)果有影響么？還是會(huì)有蛋白變性的可能性？還是提取完成后放置在-20°條件？ 3、考馬斯染液反應(yīng)時(shí)間為10min，并在一個(gè)小時(shí)之內(nèi)測定完成，這個(gè)時(shí)間是不是有問題？ |
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liuxueyan212樓2012-06-05 19:01:56
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| 4度放置時(shí)間長了肯定有問題，這個(gè)溫度下有一部分蛋白酶還是有活性的。土壤中的其他物質(zhì)有可能對(duì)考染的結(jié)果產(chǎn)生影響。 |
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3樓2012-06-05 21:27:06
gywyl1977
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1) BSA需要一批多配些，分裝在棕色瓶中，4度保存。做標(biāo)準(zhǔn)曲線不需要每次都重配，但做好每一瓶做好標(biāo)準(zhǔn)曲線后盡快用掉。啟用另一瓶時(shí)，如果間隔時(shí)間長，需要重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2）蛋白提取后肯定要冷凍保存。 3）顯色反應(yīng)一般都在半小時(shí)以內(nèi)。 |
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4樓2012-06-06 00:35:09
protein_
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| 考馬斯亮藍(lán)測定蛋白質(zhì)的原理是測定蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)的數(shù)量來定蛋白質(zhì)含量，有一定的誤差，隨著時(shí)間的推移有可能你的樣品中的蛋白質(zhì)可能在分解，樣品做出來肯定要冷凍，你可以一次多做點(diǎn)平行，真不行就定氮測定，就是麻煩點(diǎn)，祝好運(yùn) |
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5樓2012-06-08 10:23:05
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7樓2012-06-12 09:14:41
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9樓2012-06-12 09:18:09
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1.我們做標(biāo)曲用的BSA是冷凍保存的，加樣是將樣品稀釋到標(biāo)曲范圍內(nèi)后加入50ul。 2.你的蛋白不穩(wěn)定的話最好也冷凍保存。 3.考馬斯染液反應(yīng)時(shí)間為5min，反應(yīng)5min讀數(shù)就行。 |
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10樓2012-06-12 13:11:42
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