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小木蟲論壇-學(xué)術(shù)科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » PCR
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我今天做PCR時做了一個陰性對照（就是沒有加模板）但是確有引物二聚體的帶，還有目的基因的帶（不過不是太亮，就有一點(diǎn)），這是什么原因造成的？求各位蟲友幫忙分析下 [ 發(fā)自手機(jī)版 http://www.gaoyang168.com/3g ] |
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atlanticwi
金蟲 (正式寫手)
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4樓2012-05-08 23:34:44
孫啟亮
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2樓2012-05-08 22:59:04
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-05-09 14:00:13
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出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高�？赡茉蛉缦拢� 引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 |
3樓2012-05-08 23:23:30
孫啟亮
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5樓2012-05-09 08:52:51
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