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sunshinejiao

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[交流] 請教關(guān)于MTT脾淋巴細(xì)胞增殖問題

Sample TextSample Text我做脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，無菌取脾，細(xì)胞濃度為2*10e6個(gè)/ml，96孔板，每孔100μL細(xì)胞，加入10μLConA（不同濃度）孵育72小時(shí)后，加入MTT（5mg/ml）再孵育4個(gè)小時(shí)，沒有出現(xiàn)甲瓚結(jié)晶，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞還是透亮的，沒有發(fā)生任何變化。我又做了一次試驗(yàn)，取完脾細(xì)胞，孵育20小時(shí)，直接加MTT，孵育4h，有甲瓚結(jié)晶，但是很少，而且細(xì)胞還是透亮的。我想請教各位，脾細(xì)胞在96孔板里，死細(xì)胞和活細(xì)胞怎么區(qū)分啊?我那細(xì)胞都是透亮的。還有我加入MTT沒有甲瓚結(jié)晶，能說明我的細(xì)胞全部死亡了嗎（MTT我用其他細(xì)胞驗(yàn)證過，沒有問題）？非常感謝各位的回答!

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1樓 2012-05-11 10:36:01

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看天: 金幣+4, 鼓勵(lì)分享和交流 2012-05-13 00:07:45

取的新鮮組織，脾細(xì)胞還是比較混雜的，怎么確定是淋巴細(xì)胞呢？分選了？還有你裂紅嗎？
MTT像你說的，做其他細(xì)胞沒問題，那說明還是你的細(xì)胞的事。
至于死活，那你多鋪幾個(gè)孔，吸出來，胎盤藍(lán)染染看細(xì)胞死了沒

[ Last edited by telomerase on 2012-5-12 at 00:13 ]

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2樓2012-05-12 00:12:31

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sunshinejiao

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引用回帖:

2樓: Originally posted by telomerase at 2012-05-12 00:12:31:
取的新鮮組織，脾細(xì)胞還是比較混雜的，怎么確定是淋巴細(xì)胞呢？分選了？還有你裂紅嗎？
MTT像你說的，做其他細(xì)胞沒問題，那說明還是你的細(xì)胞的事。
至于死活，那你多鋪幾個(gè)孔，吸出來，胎盤藍(lán)染染看細(xì)胞死了沒

謝謝您的回答！
我沒有分選，也沒有裂紅，就直接取出來用ConA刺激，又做了一次，有一些甲瓚結(jié)晶，但還是有的孔沒有，我覺得也是取細(xì)胞時(shí)候出了問題。
還想問一下，細(xì)胞在96孔板里，還是貼壁了，能把細(xì)胞吸出來嗎？

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3樓2012-05-12 16:43:40

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telomerase

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我沒養(yǎng)過你的這個(gè)細(xì)胞
貼不貼壁，不是問題，貼了的可以消化啊，就是繁瑣點(diǎn)而已

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4樓2012-05-12 20:02:22

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神經(jīng)再生

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看天: 金幣+2, 鼓勵(lì) 常來 2012-05-13 00:07:55

增值細(xì)胞做MTT，你的密度是不是高了點(diǎn)啊，最高查一下相關(guān)文獻(xiàn)，看別人用多少細(xì)胞。教材上應(yīng)該是推薦1000-10000cells/well

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5樓2012-05-12 21:24:46

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sunshinejiao

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silicare: , 1.0-0.2ml/well 2012-05-19 10:22:43

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5樓: Originally posted by 神經(jīng)再生 at 2012-05-12 21:24:46:
增值細(xì)胞做MTT，你的密度是不是高了點(diǎn)啊，最高查一下相關(guān)文獻(xiàn)，看別人用多少細(xì)胞。教材上應(yīng)該是推薦1000-10000cells/well

看的英文文獻(xiàn)都是2*10e6個(gè)/ml

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6樓2012-05-13 21:40:44

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神經(jīng)再生

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6樓: Originally posted by sunshinejiao at 2012-05-13 21:40:44:
看的英文文獻(xiàn)都是2*10e6個(gè)/ml

可以做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線試試

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7樓2012-05-18 16:48:27

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zhuhuiling21

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請問樓主在加DMSO之前要棄去上清吧怎么可以做可以使每空棄去的上清差不多不至于使結(jié)果差異很大

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8樓2012-09-12 11:37:56

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gaorongbest

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我看了你的實(shí)驗(yàn)后覺得有問題�。�1、取脾后要很多步驟才能得到淋巴細(xì)胞的（PBS沖洗就免說了，至少要用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞、用Percoll分離液分離淋巴細(xì)胞）2、一個(gè)大鼠脾臟一般接種一個(gè)96孔板，每孔100μL細(xì)胞，我們的組織是提前用培養(yǎng)基浸潤的；3、孵育4h，可以在顯微鏡下看到明顯的藍(lán)紫色4、因?yàn)榱馨图?xì)胞是半貼壁的，所以要把每孔細(xì)胞吸到EP管后離心，測OD值得

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9樓2012-09-19 16:10:02

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熊拉拉

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9樓: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-19 16:10:02
我看了你的實(shí)驗(yàn)后覺得有問題�。�1、取脾后要很多步驟才能得到淋巴細(xì)胞的（PBS沖洗就免說了，至少要用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞、用Percoll分離液分離淋巴細(xì)胞）2、一個(gè)大鼠脾臟一般接種一個(gè)96孔板，每孔100μL細(xì)胞，我 ...

貼壁的細(xì)胞要怎么處理呢？吹打？還有加藥之后培育多久？我用的是24小時(shí)

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10樓2014-01-16 10:24:28

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檀香木2

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估計(jì)你刺激原濃度太低，我們實(shí)驗(yàn)時(shí)ConA用進(jìn)口的，終濃度4微克。

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11樓2015-04-03 19:46:33

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左左巧樂茲

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3樓: Originally posted by sunshinejiao at 2012-05-12 16:43:40
謝謝您的回答！
我沒有分選，也沒有裂紅，就直接取出來用ConA刺激，又做了一次，有一些甲瓚結(jié)晶，但還是有的孔沒有，我覺得也是取細(xì)胞時(shí)候出了問題。
還想問一下，細(xì)胞在96孔板里，還是貼壁了，能把細(xì)胞 ...

??怎么會(huì)是貼壁細(xì)胞呢？？？

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12樓2016-06-20 19:22:34

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