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[求助]
菌液PCR沒東西，但是提完質(zhì)粒能跑出來?xiàng)l帶，為什么�。�
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| 本人做目的基因和PMD18-T連接，挑菌、搖菌后，對(duì)目的基因做菌液PCR篩選陽(yáng)性菌株時(shí)沒條帶，但是我對(duì)搖出來的菌液提取質(zhì)粒，然后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行目的基因PCR時(shí)跑出目的條帶了，奇怪了，我前面有一次對(duì)菌液進(jìn)行PCR時(shí)能跑出來，菌液PCR感覺時(shí)靈時(shí)不靈，我的PCR體系：ddH2O:14.25,BUFFER:2.5,DNTP:1,引物1:1，引物2:1，菌液：5，Taq:0.25,總共是25微升體系，哪位大俠指點(diǎn)下小弟呢。 |
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atlanticwi
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atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
一度冰火: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-18 23:26:13
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
一度冰火: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-18 23:26:13
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嗯............. 為什么要糾結(jié)在菌液PCR的成功率上呢 質(zhì)粒PCR成功就已經(jīng)是可以證明插入正確的了 個(gè)人覺得菌液PCR只是鑒定步驟 還要溶壁酶來處理后才做PCR是不是有些小題大做了呢？ 個(gè)人做法流程 一邊保菌一邊鑒定 像這種TA Clone 做10~20個(gè)鑒定/plate 試片段大小再調(diào)整鑒定數(shù)量 若沒有陽(yáng)性 再次做挑菌鑒定 還是一邊保菌一邊鑒定 直到把菌挑完60%左右 若你還沒有陽(yáng)性 就挑前邊保菌搖大后提10個(gè)左右質(zhì)粒 再PCR 若還沒有 那就重新亞克隆吧.................. 說實(shí)話 從來沒有考慮過因?yàn)榫脑驍U(kuò)不出來 大腸和農(nóng)桿的我都木有碰到這種情況 |
4樓2012-05-18 22:41:52
5樓2012-05-18 23:24:46
fly12365
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10樓2012-05-21 16:39:28
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