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[求助]
菌液PCR沒東西，但是提完質(zhì)粒能跑出來條帶，為什么�。�
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| 本人做目的基因和PMD18-T連接，挑菌、搖菌后，對目的基因做菌液PCR篩選陽性菌株時沒條帶，但是我對搖出來的菌液提取質(zhì)粒，然后對質(zhì)粒進行目的基因PCR時跑出目的條帶了，奇怪了，我前面有一次對菌液進行PCR時能跑出來，菌液PCR感覺時靈時不靈，我的PCR體系：ddH2O:14.25,BUFFER:2.5,DNTP:1,引物1:1，引物2:1，菌液：5，Taq:0.25,總共是25微升體系，哪位大俠指點下小弟呢。 |
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atlanticwi
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atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
一度冰火: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-18 23:26:13
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一度冰火: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-18 23:26:13
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嗯............. 為什么要糾結(jié)在菌液PCR的成功率上呢 質(zhì)粒PCR成功就已經(jīng)是可以證明插入正確的了 個人覺得菌液PCR只是鑒定步驟 還要溶壁酶來處理后才做PCR是不是有些小題大做了呢？ 個人做法流程 一邊保菌一邊鑒定 像這種TA Clone 做10~20個鑒定/plate 試片段大小再調(diào)整鑒定數(shù)量 若沒有陽性 再次做挑菌鑒定 還是一邊保菌一邊鑒定 直到把菌挑完60%左右 若你還沒有陽性 就挑前邊保菌搖大后提10個左右質(zhì)粒 再PCR 若還沒有 那就重新亞克隆吧.................. 說實話 從來沒有考慮過因為菌的原因擴不出來 大腸和農(nóng)桿的我都木有碰到這種情況 |
4樓2012-05-18 22:41:52
5樓2012-05-18 23:24:46
fly12365
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